INTRODUÇÃO

As paraoxonases (PON) provêm de uma família multigene de enzimas que inclui PON1, PON2 e PON3, localizadas no braço longo do cromossomo 7 (entre q21.3 e q22.1) em humanos. PON1, a mais estudada, encontra-se associada à apoA-I, integrante das lipoproteínas de alta densidade¹. Embora o papel biológico mais conhecido das paraoxonases seja a prevenção da aterosclerose, elas também atuam sobre o estresse oxidativo envolvido na patogênese de outras condições, como doenças inflamatórias intestinais, neoplasias, imunossenescência, AIDS e infecções¹.

A PON1, a primeira paraoxonase descrita, é uma A-esterase que apresenta a capacidade de hidrolisar metabólitos ativos de vários inseticidas organofosforados, tais como parathion, diazinon e chlorpyrifos². O gene de PON1 possui dois polimorfismos na sua região codificadora (M55L e Q192R) e diversos outros polimorfismos em regiões promotoras. O polimorfismo L55M é responsável pela alteração da estabilidade da enzima, enquanto o polimorfismo Q192R origina aloenzimas substrato-dependentes³.

Existem evidências de que esses polimorfismos estejam relacionados a fatores de risco para o desenvolvimento de neoplasias, especialmente câncer de mama⁴, pulmão⁵, câncer renal⁶, leucemia⁷ e linfomas não-Hodgkin^8,9. No entanto, são escassos os estudos encontrados na literatura que abordam o papel das paraoxonases nas imunodeficiências primárias que cursam com infecções bacterianas recorrentes ou crônicas, como a imunodeficiência comum variável (ICV).

A ICV é a imunodeficiência primária sintomática mais comum e caracteriza-se pela redução dos níveis séricos de IgG e de pelo menos outro isotipo de imunoglobulina (IgA e/ou IgM), e pelo comprometimento da produção de anticorpos. Suas manifestações clínicas mais frequentes são infecções bacterianas de repetição ou crônicas de vias aéreas e trato gastrointestinal¹⁰, e também podem estar associadas doenças autoimunes/inflamatórias e neoplasias¹⁰. No presente estudo investigamos a relação entre os polimorfismos Q192R e L55M da Paraoxonase1 (PON1) em pacientes com imunodeficiência comum variável (ICV) e sua relação com morbidade e gravidade da doença.

PACIENTES E MÉTODOS

Casuística

Foram avaliados 61 pacientes com diagnóstico de ICV seguidos no Ambulatório de Imunodeficiências Primárias do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP). O diagnóstico de ICV foi estabelecido na presença de níveis séricos baixos de IgG e IgA e/ou IgM e comprometimento da função de anticorpo de acordo com os critérios definidos por Ameratunga et al.¹¹.

Foram analisados os seguintes parâmetros: 1) idade de início dos sintomas, idade ao diagnóstico da ICV, intervalo de tempo entre o início dos sintomas e o diagnóstico da doença e tempo total de doença; 2) taxa de internações, tempo total em dias de internação e duração de cada internação nos últimos 5 anos; 3) história de infecções de repetição e/ou infecção crônica de vias aéreas superiores (IVAS), pneumonia e diarreia; 4) presença de linfonodomegalia mediastinal e/ou abdominal, esplenomegalia, hepatomegalia, bronquiectasias; 5) alterações histológicas do trato gastrointestinal compatíveis doença celíaca (padrão celíaco-like), hiperplasia nodular linfoide (HNL), metaplasia intestinal e/ou gástrica; 6) história familiar de imunodeficiências primárias.

Todos pacientes estavam sob reposição mensal de imunoglobulina humana IV (IGIV) na dosagem de 400 a 600 mg/kg. A coleta de sangue foi realizada imediatamente antes da reposição da IGIV. Em todos os pacientes o início do tratamento com IGIV ocorreu entre um e dois meses após o estabelecimento do diagnóstico de ICV.

Não foram incluídos no estudo pacientes sob corticoterapia sistêmica prolongada, em uso de drogas citotóxicas, tabagistas e gestantes.

Como controles foram estudados 130 indivíduos voluntários saudáveis, de ambos os sexos, doadores de sangue na instituição onde o trabalho foi realizado.

Em pacientes e controles foi realizada genotipagem para os polimorfismos PON1-Q192R e PON1-L55M e atividade arilesterase da PON1.

Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética da FMUSP, onde o trabalho foi realizado, e o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido foi previamente obtido para cada paciente.

Os dados demográficos de pacientes e controles constam na Tabela 1.

Genotipagem

A extração do DNA genômico de células do sangue periférico foi feito pelo processo de salting out¹². A genotipagem foi realizada através de PCR-RFLP multiplex para os polimorfimos Q192R e L55M de PON1, com posterior digestão do fragmento de DNA amplificado com enzima de restrição Hinf-I conforme descrito por Motti¹³.

Atividade de PON1

A determinação da atividade enzimática de PON1 foi feita através de cinética enzimática conforme descrito por Lorentz¹⁴ e modificado por Oliveira-Silva¹⁵, utilizando fenilacetato como substrato.

Análise estatística

Os dados contínuos, semicontínuos e semicategóricos foram inicialmente comparados com a Curva Normal pelo teste de Distância K-S e de Shapiro e classificados quanto à normalidade pela aderência à Curva de Gauss. Os dados categóricos foram representados por frequência absoluta (n) e relativa (%); para a análise das matrizes de contingência foi utilizado o teste de Qui-quadrado de Pearson. Foi considerado para todo o estudo risco alfa menor ou igual a 5% de cometer erro tipo I ou de 1ª espécie e risco Beta menor ou igual a 20% de cometer erro tipo II ou de 2ª espécie.

RESULTADOS

Características demográficas

Foi observado discreto predomínio de mulheres no grupo de pacientes e maior número de homens no grupo controle. A média de idade foi semelhante nos dois grupos. A idade de início dos sintomas variou desde um até 59 anos de idade, com média de 17,1 anos. A média de idade ao diagnóstico foi de 30,2 anos e a do período de tempo entre o início dos sintomas e o diagnóstico de ICV foi de 13,3, variando de 1 a 58 anos. O tempo de doença, representado pelo período de tempo entre a idade de início dos sintomas e a idade atual (ao final deste estudo) variou de 6 a 73 anos com média de 25,4 (Tabela 1).

Distribuição alélica e frequência de genótipos

A distribuição alélica e a frequência de genótipos referentes ao polimorfismo PON1-Q192R foram semelhantes nos dois grupos. No entanto, em relação ao polimorfismo PON1-L55M, foi observada maior frequência do alelo 55M (p = 0,0025) e do genótipo 55MM (p = 0,003) em pacientes com ICV, em comparação ao grupo controle (Tabela 2).

Atividade arilesterase da PON1

Não houve diferença quanto à atividade arilesterase entre os grupos ICV e controle. No entanto, a comparação entre os vários genótipos demonstrou que pacientes com o genótipo 55MM apresentaram atividade menor em relação aos genótipos 55LL e 55LM (p < 0,001). No grupo controle foi observada maior atividade arilesterase da PON1 associada ao genótipo 55LL (p < 0,001) (Tabela 3).

Comparação entre parâmetros clínicos e laboratoriais e genótipos do polimorfismo PON1 L55M

Pacientes com o genótipo 55MM apresentaram maior frequência de linfonodomegalia (p = 0,026), HNL (p = 0,012), IVAS (p = 0,001), pneumonias (p < 0,001) e maior taxa de internações (p = 0,029). Não houve diferença entre os 3 grupos genotípicos em relação aos demais parâmetros analisados neste estudo.

Comparação entre parâmetros clínicos e laboratoriais e alelos 55L e 55M

Pacientes com o alelo 55L apresentaram menor frequência de HNL (p = 0,007), linfonodomegalia (p = 0,003), IVAS (p < 0,001), pneumonias (p < 0,001), taxa de internações (p = 0,019) e ocorrência de óbitos (p = 0,039) (Tabela 5), não havendo relação com os demais parâmetro analisados.

Relação entre os polimorfismos PON1-L55M e internações hospitalares

Não foi observada diferença quanto ao número de internações (p = 0,683) e tempo total de internação (p = 0,771) realizadas nos últimos 5 anos entre os três grupos genotípicos. No entanto, pacientes com o genótipo 55LM apresentaram maior média referente à duração de cada internação (p = 0,031) (Tabela 6). Não houve diferença quanto a estes 3 parâmetros em relação à presença dos alelos 55L ou 55M (Tabela 7).

Comparação entre parâmetros clínicos e laboratoriais e polimorfismos PON1 Q192R

Não foi observada relação entre a presença de alelos ou genótipos do polimorfismo PON1 Q192R e a grande maioria dos parâmetros avaliados neste estudo, exceto para a presença de hepatomegalia em relação ao genótipo 192QR (p = 0,045).

DISCUSSÃO

Neste estudo de uma coorte de pacientes com ICV foram realizadas a genotipagem dos polimorfismos L55M e Q192R da PON1, a determinação da atividade hidrolítica de PON1 e a posterior comparação destes dados com a gravidade da doença.

Na família das paraoxonases, a PON1 foi a primeira a ser identificada e ainda atualmente é a mais estudada. Tem atividades paraoxonase, arilesterase e lactonase e, em condições fisiológicas, previne as modificações oxidativas da lipoproteína de baixa densidade (LDL), desempenhando assim papel protetor nos processos ateroscleróticos. A PON1 também atua sobre o estresse oxidativo envolvido na patogênese de outras condições como doenças inflamatórias intestinais, imunossenescência, AIDS, imunodeficiências primárias e infecções².

O termo ICV engloba um grupo heterogêneo de síndromes que têm em comum níveis séricos diminuídos de IgG, IgA e/ou IgM com defeito na produção de anticorpos¹⁰. As infecções bacterianas de repetição ou crônicas ocorrem na grande maioria dos pacientes, embora possam estar presentes também infecções virais e oportunistas, doenças inflamatórias, autoimunidade e neoplasias^16-18.

Esta grande heterogeneidade de manifestações clínicas pode dificultar o reconhecimento da doença, retardando seu diagnóstico em torno de 6 ou mais anos¹⁰.

Na presente casuística, o período médio entre o início dos sintomas e o estabelecimento do diagnóstico de ICV foi de aproximadamente 13 anos, o que está bastante acima dos relatos da literatura atual¹⁶. Considerando-se a longa evolução da doença em nossos pacientes (média de 25,4 anos), é possível que esta demora do diagnóstico seja devida ao fato de que em muitos deles os sintomas iniciais ocorreram em épocas em que havia grande desconhecimento da ICV por médicos generalistas, agravado pelo falso conceito de que as imunodeficiências primárias teriam apresentação inicial quase que exclusivamente em crianças.

Na maioria dos pacientes, o diagnóstico de ICV é estabelecido entre a 3ª e a 4ª décadas da vida, sendo que apenas 20% dos casos são diagnosticados abaixo dos 20 anos de idade^10,16. Nossos dados corroboram essas observações, uma vez que a média e a mediana de idade ao diagnóstico foram 30,2 e 28 anos, respectivamente.

Pacientes com ICV apresentaram maior frequência tanto do alelo 55M quanto do genótipo 55MM em relação ao grupo controle, não sendo observadas diferenças em relação a outros polimorfismos da L55M ou Q192R. A distribuição das frequências alélicas e dos genótipos da PON1-L55M e PON1-Q192R no grupo controle foi semelhante àquela anteriormente descrita em São Paulo em doadores de sangue (dados não publicados).

A atividade arilesterase não diferiu entre pacientes e controles. A diferença observada quanto à distribuição de gêneros entre os dois grupos não interferiu nesta análise, uma vez que não têm sido relatadas diferenças entre homens e mulheres quanto a esta atividade da PON1¹⁹. Entretanto, este achado deve ser cuidadosamente analisado, considerando-se que pode haver variações individuais na atividade arilesterase associadas a diferentes causas, como sedentarismo e hábitos de vida¹⁹, doença coronariana, diabetes, acidente vascular isquêmico, cirrose hepática e doença renal²⁰.

As doenças acima não foram analisadas neste estudo dada sua baixa frequência no nosso grupo de pacientes. Também não foram consideradas no grupo controle, uma vez que os indivíduos por elas acometidos não são aceitos como doadores de sangue. No entanto, não foi possível descartar totalmente a existência de outros fatores que diminuem (tabagismo passivo, dieta aterogênica) ou aumentam (ingestão moderada de álcool, polifenóis e vitaminas C e E) a atividade da enzima²¹.

À semelhança de outras doenças como hepatites virais²², AIDS²³, cirrose^24,25 e doença de Crohn²⁶, a ICV tem sido associada a um estado de ativação imune persistente^27,28 decorrente de estímulo antigênico por agentes infecciosos e/ou associação com doenças inflamatórias, autoimunidade ou neoplasias^16-18.

Aukrust et al. relataram aumento da peroxidação lipídica³⁷ e alterações no metabolismo de glutationa e cisteína em linfócitos TCD4+³⁸ em pacientes com ICV, sugerindo que o estímulo antigênico contínuo possa desempenhar algum papel na imunopatogênese da doença, assim como no desencadeamento de determinadas condições em subgrupos de pacientes com ICV.

As infecções crônicas ou recorrentes compreendem a principal complicação da ICV constituindo, deste modo, os fatores mais provavelmente implicados na alteração do estado redox nesta condição. A maioria dos pacientes neste estudo apresentou infecções, sendo as mais comuns as de vias aéreas superiores (77,7%), pulmonares (79,3%) e diarreia (58,7%), o que está de acordo com relatos da literatura^16-18.

A atividade arilesterase não diferiu entre o grupo de pacientes com ICV e controles, assim como também não apresentou relação com os vários parâmetros analisados neste estudo. No entanto, em relação aos polimorfismos L55M, foi observada menor atividade em pacientes com o genótipo MM em comparação aos genótipos LL e LM. Este achado pode explicar, ao menos parcialmente, a menor prevalência de infecções de vias aéreas observada em portadores do alelo L (Tabela 5). Corroborando esta hipótese, atividade arilesterase mais elevada foi encontrada também nos controles sãos com o genótipo LL, o que está de acordo com os dados de literatura¹⁹.

A grande heterogeneidade das manifestações clínicas, ao lado do retardo no diagnóstico da ICV, pode contribuir para maior morbidade e mortalidade da doença. Numerosas condições presentes na ICV podem estar associadas à estimulação persistente do sistema imune como decorrência de processos infecciosos e/ou associação com doenças autoimunes¹⁰. Podem estar presentes processos linfoproliferativos benignos ou neoplásicos. Entre as manifestações consideradas benignas, as mais comuns são linfonodomegalia abdominal ou torácica, esplenomegalia e hiperplasia nodular linfoide, como a doença celíaca-like^29-30. No presente estudo, a HNL foi diagnosticada em 5 pacientes e, como pode estar relacionada à presença de Giardia lamblia^16,10, seu diagnóstico foi estabelecido somente após exclusão da presença deste protozoário. A análise dos dados demonstrou que o genótipo 55MM apresentou relação com a presença de hiperplasia nodular linfoide e linfonodomegalias abdominal e torácica.

Oito pacientes apresentaram quadro clínico e histológico compatível com doença celíaca (padrão celíaco), que também é considerada fator de estimulação crônica do sistema imunológico¹⁰. Não surpreendentemente, a pesquisa de anticorpo IgA antiendomísio foi negativa em todos os pacientes, e o diagnóstico foi estabelecido segundo critérios histológicos para doença celíaca, sendo aqui denominada "padrão celíaco".

No presente estudo, o genótipo 55MM também apresentou relação com maior morbidade, caracterizada pela maior frequência de infecções de vias aéreas e maior taxa de internações, enquanto o alelo 55M apresentou associação com maior mortalidade.

É interessante ressaltar que entre os quatro casos de óbito, apenas um paciente faleceu em decorrência de neoplasia (carcinoma gástrico metastático), e todos apresentavam o genótipo 55MM, tendo sido observada relação negativa entre a ocorrência de óbitos e a presença do alelo 55L. Os demais pacientes apresentaram quadros consuntivos com características clínicas e laboratoriais de processos inflamatórios crônicos sem etiologia conhecida.

Por outro lado, a análise dos alelos demonstrou que a menor morbidade da doença foi associada à presença do alelo 55L, uma vez que os pacientes com este alelo apresentaram menor frequência de infecções, taxa de internações, óbitos, HNL e linfonodomegalia.

Nossos resultados sugerem que o alelo 55L pode desempenhar um papel de proteção contra infecções e linfoproliferação benigna, e que isto poderia ocorrer como consequência da maior atividade enzimática associada a este alelo, resultando em maior eficácia na defesa do organismo contra agentes tóxicos externos ou mesmo àqueles inerentes ao indivíduo. Por outro lado, é possível que em pacientes com ICV, a presença do genótipo 55MM seja preditiva de maior morbidade e mortalidade da doença.

De nosso conhecimento, este constitui o primeiro relato da maior frequência do polimorfismo 55MM e do alelo 55M da PON1 em pacientes com ICV.

REFERÊNCIAS

1. Camps J, Marsillach J, Joven J. The paraoxonases: role in human disease ans methodological difficulties in measurement. Clin Rev Clin Lab Science. 2009;46:83-106.

2. Schweikert EM, Amort J, Wilgenbus P, Förstermann U, Teiber JF, Horke S. Paraoxonases-2 and -3 are important defense enzymes against Pseudomonas aeruginosa virulence factors due to their anti-oxidative and anti-inflammatory properties. J Lipids. 2012;2012:352857.

3. Costa LG, Vitalone A, Cole TB, Furlong CE. Modulation of paraoxonase (PON1) activity. Biochem Pharmacol. 2005;69:541-50.

4. Hussein YM, Gharib AF, Etewa RL, ElSawy WH. Association of L55M and Q192R polymorphisms in paraoxonase 1 (PON1) gene with breast cancer risk and their clinical significance. Mol Cell Biochem. 2011;351:117-23.

5. Elkiran ET, Mar N, Aygen B, Gursu F, Karaoglu A, Koca S. Serum paraoxonase and arylesterase activities in patients with lung cancer in a Turkish population. BMC Cancer. 2007;7:48.

6. Uyar OA, Kara M, Erol D, Ardicoglu A, Yuce H. Investigating paraoxonase-1 gene Q192R and L55M polymorphism in patients with renal cell cancer. Genet Mol Res. 2011;10:133-9.

7. Kokouva M, Koureas M, Dardiotis E, Almpanidou P, Kalogeraki A, Kyriakou D, et al. Relationship between the paraoxonase 1 (PON1) M55L and Q192R polymorphisms and lymphohaematopoietic cancers in a Greek agricultural population. Toxicology. 2013;307:12-6.

8. Kerridge I, Lincz L, Scorgie F, Hickey D, Granter N, Spencer A. Association between xenobiotic gene polymorphisms and non-Hodgkin's lymphoma risk. Br J Haematol. 2002;118:477-81.

9. De Roos AJ, Gold LS, Wang S, Hartge P, Cerhan JR, Cozen W, et al. Metabolic gene variants and risk of non-Hodgkin's lymphoma. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006;15:1647-53.

10. Cunningham-Rundles C. The many faces of common variable immunodeficiency. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2012;2012:301-5.

11. Ameratunga R, Woon ST, Gillis D, Koopmans W, Steele R. New diagnostic criteria for Common Variable Immune Deficiency (CVID), which may assist with decisions to treat with intravenous or subcutaneous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 2013;174:203-11.

12. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1998;16:1215.

13. Motti C, Dessì M, Gnasso A, Irace C, Indigeno P, Angelucci CB, et al. A multiplex PCR-based DNA assay for the detection of paraoxonase gene cluster polymorphisms. Atherosclerosis. 2001;158:35-40.

14. Lorenz K., Flatter B., Augustine E. Aryl esterase in serum: elaboration and clinical application of fixed incubation method. Clin Chem. 1979;25:1714-20.

15. Oliveira SA, Mansur AP, Ribeiro CC, Ramires JAF, Annichino-Bizzacchi JM. PON 1 M/L55 mutation protects high-risk patients against coronary artery disease. Int J Cardiol. 2004;94:73-7.

16. Cunningham-Rundles C, Bodian C. Common variable immunodeficiency: clinical and immunological features of 248 patients. Clin Immunol. 1999;92:34-48.

17. Kokron CM, Errante PR, Barros MT, Baracho GV, Camargo MM, Kalil J, et al. Clinical and laboratory aspects of common variable immunodeficiency. An Acad Bras Cienc. 2004;76:707-26.

18. Quinti I, Soresina A, Spadaro G, Martino S, Donnanno S, Agostini C, et al. Long-term follow-up and outcome of a large cohort of patients with common variable immunodeficiency. J Clin Immunol. 2007;27:308-16.

19. Précourt LP, Amre D, Denis MC, Lavoie JC, Delvin E, Seidman E, et al. The three-gene paraoxonase family: physiologic roles, actions and regulation. Atherosclerosis. 2011;214:20-36.

20. Mackness B, Durrington P, McElduff P, Yarnell J, Azam N, Watt M, et al. Low paraoxonase activity predicts coronary events in the Caerphilly Prospective Study. Circulation. 2003;107:2775-9.

21. Van der Gaag MS, van Tol A, Scheek LM, James RW, Urgert R, Schaafsma G, et al. Daily moderate alcohol consumption increases serum paraoxonase activity: a diet-controlled randomised intervention study in middle-aged men. Atherosclerosis.1999;147:405-10.

22. Sandler NG, Koh C, Roque A, Eccleston JL, Siegel RB, Demino M, et al. Host response to translocated microbial products predicts outcomes of patients with HBV or HCV infection. Gastroenterology. 2011;141:1220-30.

23. Brenchley JM, Price DA, Schacker TW, Asher TE, Silvestri G, Rao S, et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 2006;12:1365-71.

24. Urbaschek R, McCuskey RS, Rudi V, Becker KP, Stickel F, Urbaschek B, et al. Endotoxin, endotoxin neutralizing-capacity, sCD14, sICAM-1, and cytokines in patients with various degrees of alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 2001;25:261-8.

25. Harte AL, da Silva NF, Creely SJ, McGee KC, Billyard T, Youssef-Elabd EM, et al. Elevated endotoxin levels in non-alcoholic fatty liver disease. J Inflamm (Lond). 2010;7:15.

26. Pastor Rojo O, López San Román A, Albéniz Arbizu E, de la Hera Martínez A, Ripoll Sevillano E, Albillos Martínez A. Serum lipopolysaccharide-binding protein in endotoxemic patients with inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 2007;13:269-77.

27. Aukrust P, Berge RK, Müller F, Ueland PM, Svardal AM, Frøland SS. Elevated plasma levels of reduced homocysteine in common variable immunodeficiency-a marker of enhanced oxidative stress. Eur J Clin Invest. 1997;27:723-30.

28. Aukrust P, Swardal AM, Müller F, Lunden B, Berge RK, Ueland PM, et al. Increased levels of oxidized glutathione in CD4+ lymphocytes associated with disturbid intracellular redox balance in human immunodeficiency virus type I infection. Blood. 1995;86:258-67.

29. Freedman AS, Friedberg JW, Aster JC. Clinical presentation and diagnosis of non-Hodgkin lymphoma. UpToDate, Jan 2012.

30. Malamut G, Verkarre V, Suarez F, Viallard J-F, Lascaux A-S, Cosnes J, et al. The enteropathy associated with Common Variable Immunodeficiency: the delineated frontiers with Celiac Disease. Am J Gastroenterol. 2010;105:2262-75.

Trabalho ganhador do Prêmio Oliveira Lima 2013 da ASBAI.

• Voltar ao Topo
• Próximo Número