Os neutrófilos são os leucócitos mais frequentemente presentes no sangue periférico de um indivíduo em condições normais de saúde, e participam ativamente da defesa inata do organismo contra patógenos¹, utilizando diversos mecanismos para a eliminação dos mesmos, que incluem a fagocitose, geração espécies reativas de oxigênio (EROS), liberação de enzimas líticas presentes em seus diversos grânulos citoplasmáticos^2,3 e além disso, ainda são capazes de formar armadilhas extracelulares (neutrophil extracellular traps - NETs) para capturar e matar microrganismos⁴.

Estas NETs são um tipo de armadilha liberadas pelos neutrófilos em um processo de morte celular denominado netose⁵. Sua estrutura consiste basicamente por fibras de cromatina descondensadas de aproximadamente 15~17 nm de diâmetro e histonas⁴, porém estudos com espectrometria de massa identificaram a presença de outras proteínas, que estão presentes nos grânulos citoplasmáticos quando a célula está integra. Exemplos de tais proteínas são α-defensinas, azurocidina e lactoferrina⁶.

Este trabalho pretende revisar os acontecimentos desde os estímulos celulares responsáveis por desencadear a netose e sua subsequente liberação de NETs, dando ênfase no impacto que tais estruturas podem causar no organismo, tanto na saúde quanto seu envolvimento em processos autoimunes.

Fatores desencadeadores e eventos seguintes à ativação

As NETs podem ser induzidas por diversos fatores, que incluem microrganismos como fungos^7-11, bactérias^4,12-16, protozoários^17,18 e vírus^19-21, citocinas proinflamatórias (TNF-α, IL-8)²² e vários autoanticorpos^22,23.

Após receber um estímulo de um ou mais fatores desencadeadores, o neutrófilo perde seu formato arredondado, se tornando mais plano e se adere firmemente ao endotélio. O núcleo celular perde seus lóbulos característicos²⁴. Enzimas granulares, como elastase neutrofílica e mieloperoxidase, são conduzidas para o núcleo⁴. A elastase neutrofílica é responsável por deteriorar a histona de ligação H1 e modificar as histonas matrizes, levando à descondensação da cromatina nuclear. A mieloperoxidase se mostrou útil em elevar o índice de deterioração ligado à elastase neutrofílica^25,26. A histona H3 sofre citrulinação, que é a conversão de arginina carregada positivamente em citrulina, que é necessário para a descondensação da cromatina celular. Esta citrulinação se mostrou ser catalisada pela peptidilarginina deiminase 4 (PAD4), uma enzima que é expressa em leucócitos e possui funções imunomodulatórias^27,28. Estudos de Li e colaboradores, em que ratos tiveram o gene que codifica tal enzima deletados, tais perderam a habilidade de formar NETs²⁹.

Após estimulado e ativado, o neutrófilo ativa seu complexo enzimático NADPH oxidase e inicia um processo denominado de explosão respiratória, e levará à redução do oxigênio molecular O₂ em O_2- e ulterior transformação deste, com ou sem envolvimento enzimático da superóxido dismutase, em peróxido de hidrogênio (H₂O₂)^24,30.

O envolvimento e importância de tais radicais livres foram descritas em estudos de Bianchi e colaboradores (2009), onde neutrófilos de indivíduos portadores da doença denominada Doença Granulomatosa Crônica, uma doença onde ocorrem mutações nos genes responsáveis por codificar o complexo enzimático NADPH oxidase^31,32 não eram capazes de formar NETs em condições normais. Como as espécies reativas de oxigênio são importantes também no processo de digestão de microrganismos fagocitados por neutrófilos e macrófagos, indivíduos com esta doença apresentarão infecções recorrentes durante toda a vida^30,32.

Compostos que constituem as NETs.

As NETs são compostas basicamente por cromatina nuclear descondensada juntamente com proteínas, onde a maioria delas vem dos grânulos dos neutrófilos e as outras proteínas são citoplasmáticas e nucleares (histonas).

As moléculas presentes nas NETs são moléculas oriundas de diversas partes da célula, como do núcleo, citoplasma e grande quantidade das moléculas presentes nos grânulos. Fisiologicamente, as moléculas presentes nos grânulos neutrofílicos possuem atividade antimicrobiana, e estas são liberadas durante o processo de degranulação dos neutrófilos e também por se misturar ao fagossomo, quando os neutrófilos realizam o processo de fagocitose de microrganismos³³.

Apesar de terem função na captação e aniquilação de microrganismos, os compostos que constituem as NETs são estruturas intracelulares, e o fato de elas serem liberadas para o meio extracelular pode gerar danos ao organismo, caso elas não sejam eliminadas de forma eficiente, podendo servir como alvo para produção de anticorpos^34-36.

Diferenças entre apoptose e netose

Apoptose é o tipo mais bem estudado de morte celular, sendo um tipo de morte celular não inflamatório³⁷. Este tipo de morte celular pode ser iniciado por dois modos, o modo extrínseco e o modo intrínseco. O modo extrínseco de início da apoptose ocorre quando há ativação dos receptores de morte celular por algum de seus ligantes específicos, isto fará com que as caspases iniciadoras (caspase-8 ou a caspase-10) iniciem a apoptose, clivando e ativando diretamente as caspases efetoras da apoptose^38,39. O modo intrínseco de início da apoptose ocorre quando há algum tipo de dano no DNA, hipóxia ou estresse celular, que levará à liberação do citocromo-c da mitocôndria, que irá formar um complexo com a caspase-9 e o fator de ativação da apoptose-1 (APAF-1), denominado complexo apoptossomo. O papel do apoptossomo na inicialização da apoptose intrínseca é similar ao papel das caspases iniciadoras no modo extrínseco de inicialização da apoptose, que é clivar e ativar a caspase-3, uma caspase efetora^37-39.

Após a ativação das caspases a apoptose se inicia. A célula se contrai e perde sua conexão com a matriz extracelular, a cromatina se condensa e ocorre fragmentação do DNA e da membrana celular e posterior formação de vesículas apoptóticas, compostas por fragmentos de DNA envolvidos pela membrana celular^37,40. Após serem formadas as vesículas apoptóticas, que deixará a célula com uma aparência vulgarmente denominada de “cacho de uva”⁴¹ e esta célula irá liberar e expor moléculas em sua superfície para que possa ser fagocitada e degradada pelos fagócitos^42,43. Primeiramente, sinais de “me encontre” são liberados, para que esta célula possa ser encontrada pelos fagócitos⁴³. Em seguida, moléculas de “me fagocite” serão expostas na superfície da célula em apoptose, para que os fagócitos possam então englobar e degradar estas vesículas⁴⁴. Logo em seguida o fagócito libera citocinas anti-inflamatórias, para que respostas imunes sejam suprimidas e não haja dano tecidual^45,46.

As diferenças entre os processos de apoptose e netose são claramente vistas durante todos os processos. Primeiramente, estudos de Remijsen e colaboradores (2010)⁴⁷ mostraram que as caspases não estão ativas durante o processo de morte celular por netose. As membranas dos grânulos dos neutrófilos são desintegradas durante a netose, para que os seus componentes possam se misturar com a cromatina, porém o citoplasma se mantém intacto, o que não ocorre na apoptose, uma vez que uma grande desorganização durante tal processo acontece^14,47. A cromatina durante a netose se apresenta descondensada, contrariamente à apoptose, que ocorre uma condensação nuclear e consequente picnose nuclear e ulterior fragmentação do mesmo^14,48. A formação de vesículas apoptóticas também não pode ser observada na netose¹⁴. Outra diferença é que a célula que está em um processo de apoptose tende a se desagregar da matriz extracelular, porém a célula que está em processo de netose se fixa na matriz e apresenta sinais de contração, provavelmente para que as NETs possam ser liberadas com mais eficácia^5,49.

Relações entre microrganismos e as NETs

A liberação das NETs é induzida por uma grande variedade de fatores, e dentre esses fatores, podem ser citados várias estruturas microbianas, como estruturas das paredes celulares de bactérias (tanto Grampositivas quanto Gram-negativas) ou até mesmo os microrganismos completos, como bactérias^4,12-16, vírus^19-21, fungos^7-11,50,51, e protozoários^17,18. As NETs em tais situações, possuem um papel de contenção do microrganismo, pois elas são capazes de prender os microrganismos, evitando que os mesmos se espalhem pelo organismo⁴. Elas ainda são capazes de inativar fatores de virulência⁵² ou até mesmo matar tais microrganismos, devido às proteínas presentes nas NETs, que entram em contato com os mesmos, quando são liberadas pelos neutrófilos.

Bactérias

Yipp e colaboradores (2012)¹⁵ realizaram um estudo onde ratos foram contaminados com cepas de Staphylococcus aureus e depois divididos em dois grupos. Para um grupo foi administrado uma enzima capaz de clivar as NETs (DNase), e para outro não. O grupo ao qual foi administrado DNase apresentou número bastante elevado de bactérias na corrente sanguínea comparado ao grupo que não recebeu DNase.

De acordo com estudos de Brinkmann e colaboradores (2004)⁴, os fatores de virulência da Salmonella typhimurium (Invasina IpaB e adesina IcsA) e Staphylococcus aureus (α toxina) estavam significantemente diminuídos quando estes patógenos estavam “presos” às NETs, comparados às bactérias que não estavam, mostrando que as proteínas presentes nas NETs podem ser responsáveis por degradar estes fatores de virulência.

Protozoários

Em estudos realizados por Guimarães-Costa e colaboradores, em 2009¹⁸, as NETs demonstraram ser capazes de capturar Leishmania amazonensis, e tais parasitas quando capturados por estas estruturas apresentavam um sinal de dano celular e morte do parasita. Ainda no mesmo estudo, a adição de um anticorpo anti-histona foi capaz de aumentar a sobrevivência de tais parasitas capturados pelas NETs em até 42%, e o efeito letal das histonas sobre os parasitas foi confirmado incubando histonas purificadas e promastigotas de Leishmania amazonensis, onde apenas 38% dos parasitas continuaram vivos.

Fungos

Os fungos são também responsáveis por induzir a formação de NETs, e seu efeito no controle do crescimento fúngico pode ser observado em experimentos realizados com Candida albicans⁵⁰, e foi evidenciado que a calprotectina, uma proteína quelante de zinco⁵¹, que está presente nas NETs, consegue suprimir o crescimento de C. albicans competindo pelo zinco com o fungo.

Estudos de Rocha e colaboradores, de 2014, mostraram que cepas de Cryptococcus neoformans que não possuem cápsula são capazes de induzir a formação e liberação de NETs pelos neutrófilos, porém cepas providas de cápsulas não conseguem induzir a formação de NETs. No estudo, uma provável causa para o mesmo seria que proteínas capsulares podem inibir a explosão respiratória, diminuindo a presença de espécies reativas de oxigênio. Ainda no mesmo estudo, quando estas cepas fúngicas são incubadas com NETs, elas se tornam inviáveis, tanto cepas que conseguem induzir NETs (cepas desprovidas de cápsula) quanto cepas que não são capazes (cepas capsuladas)⁵³.

Vírus

Além das bactérias, fungos e parasitas, as NETs ainda podem ser induzidas por vírus, que incluem o vírus HIV-1 e Influenza-A^19,20. Porém, para que o neutrófilo possa produzir e liberar suas armadilhas, neste caso é necessário que o neutrófilo reconheça as partículas virais via receptores tipo toll 7 e 8 (tolllike receptors, TLR-7 e TLR-8). Os neutrófilos têm a capacidade de distinguir as células infectadas das células normais do organismo pelos antígenos virais expressos na superfície da célula, fazendo com que mesmo quando não seja possível a interação da partícula viral com os receptores de reconhecimento padrão, ainda sim é possível a síntese e liberação de NETs^19-21.

O papel das NETs no processo viral seria se ligar à partícula viral e a neutralizar. As partículas virais são capturadas pelas NETs, isso faz com que elas não mais consigam chegar e/ou se ligar a sua célula-alvo^19,54. A neutralização das partículas virais ocorre por meio das enzimas granulares (mieloperoxidase e α-defensinas) associadas às armadilhas, que pode ser associado aos resultados obtidos nas pesquisas de Saitoh e colaboradores, em 2012²⁰, que mostraram que o tratamento de neutrófilos com inibidores de mieloperoxidase e anticorpos anti-α-defensinas diminuiu a taxa em que as partículas virais foram neutralizadas.

Apesar de tudo, os microrganismos já possuem formas de evadir do alvo de destruição das NETs. Em alguns estudos, como os de Beiter e colaboradores (2006)¹² e Buchanan e colaboradores (2006)¹³, Streptococcus pneumoniae e outros estreptococos do grupo A são capazes de produzir endonucleases, que são enzimas capazes de clivar moléculas de DNA, para que assim possam evitar a captura pelas NETs ou até mesmo se livrar das mesmas, caso já tenham sido capturadas, embora outros estudos já mostrem formas de driblar essa degradação, como os estudos de Neuman e colaboradores (2014), que mostraram que a catelicidina (LL-37) é muito eficaz na prevenção da degradação das NETs por endonucleases produzidas por Staphylococcus aureus⁵⁵.

Pseudomonas aeruginosa evadem das NETs de forma diferente. Elas são capazes de absorver moléculas de sialoglicanos, que são presente na maioria das células de mamíferos, confundindo os neutrófilos, desta forma os neutrófilos passam a secretar citocinas anti-inflamatórias, como IL-10, que inibem a liberação de NETs por outros neutrófilos, para evitar um ataque a estruturas do “próprio organismo”⁵⁶.

Outro modo de evasão dos microrganismos contra as NETs é visto por espécies de Aspergillus, que produzem uma hidrofobina (RodA), que é capaz de envolver a superfície dos conídios (mas não de hifas), evitando o contato e reconhecimento de tais estruturas pelos neutrófilos e consequente não liberação de NETs pelos mesmos⁵⁷.

Relações entre desordens autoimunes e as NETs

Apesar das NETs terem uma relação direta com os microrganismos e sua morte/neutralização, a sua produção em excesso ou o seu acúmulo pode resultar em processos inflamatórios, doenças vasculares como trombose e aterosclerose, e também processos autoimunes^22,58,60.

As doenças autoimunes se caracterizam por uma desordem imunológica, onde as células de defesa do organismo reconhecem tecidos do próprio organismo como invasores e os atacam, causando vários tipos de danos, dependendo do tecido que está sob ataque⁶¹. O processo de desenvolvimento de uma doença autoimune é muito complexo, porém vários estudos admitem que a exposição de antígenos intracelulares seja de muita importância para a inicialização do processo de produção de autoanticorpos pelos plasmócitos⁶¹, e durante a liberação de NETs pelos neutrófilos, uma gama de estruturas intracelulares são liberada para o meio extracelular, que pode ser o necessário para que seja desencadeado uma resposta imune contra tais estruturas, em pessoas que têm uma predisposição^61-63. Ainda admitem-se hipóteses que infecções possam estar ligadas a processos autoimunes⁶². Admitindo-se que microrganismos levam à formação de NETs, corrobora-se a hipótese de que as NETs também sejam fontes de autoantígenos em processos autoimunes, uma vez que a liberação de NETs está aumentada em processos infecciosos^62-64.

Lúpus eritematoso sistêmico

Lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença autoimune, onde o sistema imune perde a tolerância às estruturas do próprio organismo e passa a produzir anticorpos contra eles, principalmente anticorpos anti-DNA, anti-cromatina e anticorpos contra proteínas relacionadas ao núcleo⁶⁵. Os anticorpos que são presentes no lúpus eritematoso sistêmico são reativos à moléculas liberadas pelas NETs.

Estudos de Hakkim e colaboradores (2007) mostraram que pacientes com LES têm uma atividade menor da DNase I, o que faz com que as NETs sejam degradadas com mais dificuldade, ou até mesmo não sejam degradadas, e um título maior de anticorpos anti-DNA foi encontrado em tais pacientes³⁶.

O complemento 1q (C1q) é uma proteína que faz parte do sistema complemento. Sua função é se ligar a anticorpos que já se ligaram a algum antígeno, ou mesmo em estruturas bacterianas ou virais, como cápsulas e envelopes, respectivamente. Esta ligação forma o complexo C1, que dará inicio à via de ativação clássica do sistema complemento⁶⁶. Estudos feitos por Leffler e colaboradores (2012)⁶⁷ revelaram que a proteína C1q se liga às NETs com grande afinidade, fazendo com que a cascata do sistema complemento seja ativada pela via clássica, e ocorrendo uma queda nas proteínas do sistema complemento. A ligação entre a C1q e as NETs também contribuiu para que a DNase perdesse sua efetividade em degradar as NETs, pois a C1q age como um envoltório protetor para as mesmas⁶⁷.

Outro ponto interessante do estudo de Leffler e colaboradores (2012)⁶⁷ é que anticorpos anti-DNA comumente encontrados em pacientes com LES podem reagir de forma cruzada com a enzima DNase, inativando-a⁶⁷. Isso gera um loop, podendo ser explicado da seguinte maneira: pacientes com LES têm uma atividade menor da enzima DNase, responsável por clivar as NETs; as NETs quando não clivadas servem de fonte de autoantígenos para a produção de anticorpos; anticorpos anti-DNA são produzidos; a proteína C1q liga-se às NETs dificultando ainda mais a ação da DNase; anticorpos anti-DNA reagem com a DNase, fazendo o seu nível funcional cair ainda mais; menos NETs serão degradadas; mais anticorpos serão produzidos⁶⁷.

Vasculite de pequenos vasos

Vasculite de pequenos vasos é uma doença autoimune, caracterizada pela inflamação necrosante de vasos sanguíneos em diversas partes do organismo, dentre as mais comuns a pele e os pulmões²³. Pacientes com vasculite de pequenos vasos geralmente possuem anticorpos anti-citoplasma de neutrófilos, também chamado de ANCA, com grande reatividade com a proteinase-3 (PR3) ou mieloperoxidase (MPO)²³, ambas moléculas presentes nas NETs.

Estudo de Nakazawa e colaboradores (2012) mostra que uma droga denominada propiltiouracil, utilizada no tratamento de hipertireoidismo, mostrou que quando os neutrófilos são induzidos a liberar NETs in vitro na presença de tal droga, as NETs que em situações normais são uma rede frouxa de cromatina susceptíveisà degradação por DNases, passam a ter uma conformação aberrante, condensada e globosa resistente à degradação por DNase^34,35. Nakazawa e colaboradores (2012) também mostram em seus estudos que as estruturas aberrantes formadas na presença da droga propiltiouracil, quando instilada em ratos, levaram estes a desenvolver anticorpos anti-mieloperoxidase e também lesões nos capilares pulmonares semelhantes aos encontrados em vasculite de pequenos vasos em humanos³⁴.

LL-37 é uma molécula presente nas NETs que consegue inibir a degradação dos filamentos de cromatina pelas nucleases, como diz os estudos de Neumann e colaboradores, de 2014. A presença de LL-37 em pacientes com vasculite de pequenos vasos foi descrita nos estudos de Zhang e colaboradores, em 2013. Neste estudos, a presença de LL-37 circulante estava aumentada, gerando uma hipótese de que este peptídeo possa estar relacionado com a falha na degradação das fibras de cromatina liberada pelas NETs, facilitando para as células dendríticas o seu transporte e possível fonte de autoanticorpos^68,69.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

As armadilhas extracelulares produzida por neutrófilos fazem parte da imunidade do organismo contra agentes patogênicos, onde os defeitos na sua função, assim como em qualquer outro ponto da imunidade inata ou adaptativa, podem gerar problemas para a saúde no indivíduo, pois elas são importantes para que haja a contenção de microrganismos no local da infecção, prevenindo que estes sejam disseminados, levando a mais danos ao organismo e maior dificuldade na sua eliminação. Também se demonstraram importantes em enfraquecer bactérias, destruindo seus fatores de virulência, ou até mesmo matando microrganismos diretamente. Porém, além de ser tão importante para combate às infecções, quando não eliminadas corretamente ou sua produção for aumentada de forma anormal, estas NETs deixam de efetuar seu papel com eficácia e passam a ser mais um problema para o organismo do que uma solução, sendo uma provável causa da perda da autotolerância do sistema imune à estruturas do próprio organismo, podendo levar a desordens autoimunes em pessoas predispostas e também servir de uma fonte constante e inesgotável de autoantígenos para produção de autoanticorpos, que leva a danos e perda de função de vários tecidos corporais.

Ainda há muito a se saber sobre as NETs, pois esta é uma estrutura relativamente desconhecida, mas há grande potencial para novas e grandes descobertas utilizando-as como alvo, indo desde possíveis marcadores para doenças que sejam relacionadas com as NETs, até mesmo para o tratamento de tais doenças.

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