INTRODUÇAO

As manifestaçoes clínicas da alergia ao pólen podem ocorrer durante todo o ano ou durante a primavera, época de polinizaçao mais intensa. No Sul do Brasil, a polinizaçao de gramíneas inicia em setembro e pode se estender até janeiro. As variaçoes climáticas e o índice de precipitaçao pluviométrica controlam a época de polinizaçao e a carga atmosférica do pólen, resultando em modificaçoes na intensidade e no início dos sintomas em cada estaçao^1,2. Várias espécies de gramíneas produtoras de pólen têm sido reconhecidas como alergênicas, entre elas, Lolium perenne, Poa pratensis, Phleum pratense, Dactylis glomerata e Cynodon dactylon^2,3.

Lolium multiflorum, gramínea conhecida como azevém, é a principal causadora de polinose na regiao Sul do Brasil^4,5. Estudos imunológicos indicam que há até 95% de homologia antigênica entre as gramíneas Lolium multiflorume Phleum pratense. Phleum pratenseé uma gramínea de relevância alergênica em regioes de clima temperado. Entre seus alérgenos se destacam: Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 e Phl p 6. Os grupos 1 e 5, sao os mais prevalentes na sensibilizaçao de pacientes³.

Imunoterapia específica para alérgenos é o único tratamento disponível que pode limitar a progressao das doenças alérgicas e prevenir o surgimento de novas sensibilizaçoes alérgicas^6-8.

Os testes cutâneos de leitura imediata, por puntura ou intradérmicos, sao usados há décadas como forma de identificar a presença de anticorpos IgE específicos para alérgenos⁹. Sao altamente sensíveis para diagnóstico das doenças atópicas com rapidez e reprodutibilidade^10.11. Testes cutâneos por puntura ou intradérmicos em indivíduos conhecidamente alérgicos foram ambos validados para avaliar a potência biológica dos extratos de imunoterapia, e ainda permitir a comparaçao da potência de extratos de diferentes fabricantes^12-16.

Extratos alergênicos sao produzidos para diagnóstico e tratamento de doenças mediadas por IgE. Esses extratos sao constituídos por complexos de materiais biológicos^17-19. A padronizaçao é o processo de avaliaçao da potência de determinado extrato, comparando-o a amostras de referência com quantidades conhecidas de alérgenos específicos^16,20. Embora seja altamente desejável, nem todos os extratos utilizados na prática clínica sao padronizados, nesse caso cada produtor deve ter seu controle interno para assegurar um nível aceitável de comparaçao a cada novo lote preparado^19,21.

Os objetivos deste estudo sao comparar em testes de puntura as potências de extratos europeus de Phleum pratenseem relaçao ao extrato de referência do FDA (Food and Drug Administration) dos Estados Unidos da América.

MATERIAL E MÉTODOS

Para documentar a potência relativa em testes cutâneos de extratos alergênicos de Phleum pratensede diferentes fabricantes, o delineamento selecionado foi um ensaio clínico de superioridade de potência, com a finalidade de avaliar um dos pilares do tratamento com extratos alergênicos. O estudo foi triplo cego, randômico, multicêntrico e internacional. Os dados gerados neste Serviço foram analisados interinamente. Os participantes foram recrutados através de notificaçao eletrônica via intranet (sistema eletrônico do Complexo Hospital de Clínicas - UFPR), e que tivessem sintomas típicos de rinoconjuntivite alérgica durante o período da primavera.

Foram selecionados os sujeitos de qualquer sexo ou raça, com idade entre 18 e 55 anos, com histórico clínico sazonal compatível com possível alergia ao pólen e confirmada por resultado positivo para teste de puntura (diâmetro médio de pápula de 8 mm) para Phleum pratensecom extrato contendo 10.000 AU/mL, Greer Laboratories, EUA. Nenhum dos sujeitos havia usado medicaçao nos últimos 15 dias que pudesse interferir com os resultados de testes cutâneos.

Os critérios de exclusao foram os seguintes: espirometria com volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF₁) abaixo de 80% do valor normal previsto; gravidez ou pacientes femininos sem prática contraceptiva aceitável; pacientes com histórico de anafilaxia ou reaçoes alérgicas graves; necessidade de anti-histamínicos para controlar sintomas; administraçao de corticoide nos últimos 15 dias, ou de açao prolongada nos últimos 90 dias; portadores de dermatite atópica ativa; hiperreatividade cutânea - controle negativo superior a 3 mm de diâmetro ou tendência a urticária; pacientes em vigência de imunoterapia ou com história de realizá-la nos últimos 5 anos.

Testes cutâneos foram realizados na regiao dorsal de 15 pacientes alérgicos, selecionados conforme critérios de inclusao e exclusao, por história clínica sugestiva de alergia a Loliume teste cutâneo de puntura com alta reatividade a este alérgeno.

O dispositivo usado para puntura foi lanceta de aço inoxidável, calibrada e descartável Alk Lancet^®.

Extratos alergênicos

Para reduzir esta diferença em potência, o concentrado de extrato dos Estados Unidos da América foi diluído em 50%, portanto, o concentrado de extrato americano de Phleum pratenseteria 5.000 BAU/mL. Através de testes de puntura foram comparadas as potências dos seguintes extratos alergênicos para imunoterapia sublingual: (A) Soluprick^®(30 HEP/mL), e (B) Grazax^®75.000 SQ-T, ambos os extratos feitos da mesma matéria prima da ALK-Abelló; (C) Staloral^®e (D) Oralair^®, com 300 IR/mL, Stallergènes, França. O extrato de origem norte-americana (E) é o padrao Center for Biologics Evaluation and Research/Food and Drug Administration USA, CBER/FDA de 10.000 BAU/mL.

A quantidade de antígeno Phl p 5 em microgramas por mililitro de cada extrato alergênico é de uma publicaçao prévia: 15 µg em Grazax^®; 8,4 µg em Staloral^®; 5,2 µg em Oralair^®; 9,2 µg em Soluprick^®, e 64 µg no extrato original do FDA²².

O diluente utilizado foi glicerina 50%, fornecido por Greer Laboratories^®. Os extratos de pólen de Phleum pratenseforam testados em duplicata em cada sessao de testes cutâneos por paciente, portanto, em resultado quádruplo. As formulaçoes em comprimidos foram dissolvidas no mesmo diluente glicerinado. Para os testes por puntura todos os extratos foram usados em forma de concentrados, e nas diluiçoes 1:3, 1:10, e 1:30.

Os extratos alergênicos de Phleum pratensede diferentes fontes e diluiçoes foram selecionados de forma cega e aplicados em lados opostos do dorso do indivíduo. Os frascos de concentrados identificados com as letras A-E e os controles negativos e positivos foram mantidos em códigos, e revelados apenas ao final do estudo.

Testes cutâneos

Para obter resultados mais confiáveis, antes de iniciar os testes de puntura com os extratos em estudo, o técnico designado para aplicaçao dos testes foi submetido a treinamento. O teste de proficiência consistiu na aplicaçao alternada de histamina e soluçao salina no antebraço do paciente. Ambas, histamina e salina foram aplicadas 10 vezes, e a média do diâmetro das pápulas usadas para calcular o coeficiente de variaçao, que nao deveria ser superior a 20%. O teste foi repetido até o aplicador ser aprovado.

Os testes de puntura para cada extrato, concentrados e diluídos, foram aplicados em quadruplicata - dois lados do dorso, em dois dias nao consecutivos. O aplicador do teste soube somente quais eram os controles positivos e negativos, assim como os frascos com os concentrados. Além disso, o controle negativo foi usado para confirmar a reatividade da pele do paciente, conforme descrito nos critérios de inclusao.

Os resultados foram avaliados após 15 minutos pelo contorno da pápula e eritema com caneta porosa e transferidos com adesivo transparente para uma folha branca de papel. Esse método, utilizando a fita adesiva, é padrao ouro no registro de testes cutâneos, utilizado em diversos estudos.

Após 7 a 15 dias, durante a segunda sessao, a mesma rotina foi estabelecida e o teste foi repetido, para conseguir o total de quatro repetiçoes.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná, e os participantes, após informaçao sobre o protocolo, assinaram Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

RESULTADOS

Foram analisados testes cutâneos por puntura de 15 pacientes, com idade entre 18-48 anos e história clínica compatível com rinoconjuntivite alérgica sazonal ao pólen de gramíneas. Esses pacientes realizaram duas visitas ao serviço de referência e foram submetidos a testes no dorso à esquerda e à direita, com padrao em duplicata, dos extratos analisados em suas diluiçoes padronizadas.

Os dados obtidos foram submetidos à mensuraçao manual, em régua milimetrada, por um único examinador. Foram avaliadas média, desvio padrao, mediana e intervalo de confiança de todos os dados, descritos nas Tabelas 1 e 2. Considerou-se resultado estatisticamente significativo para o valor obtido de p < 0,05. Nao houve diferença significativa entre os testes realizados no primeiro e segundo dias (p = 0,37) na comparaçao dos diâmetros médios das pápulas obtidas com extratos concentrados, na diluiçao 1:3 e também 1:10 (respectivamente p = 0,20 e p = 0,33). Para comparaçao entre os extratos na diluiçao 1:30, foi utilizado o teste de Wilcoxon, e tampouco revelou diferenças significativas nos valores dos diâmetros médios das pápulas (p = 0,30). Nao houve diferença entre os testes realizados no dorso à direita e à esquerda, pelo teste Anova (p = 0,97).

No segundo dia de testes, a média obtida das pápulas do extrato A concentrado foi de 16,7 mm na diluiçao 1:3; de 14,3 mm na diluiçao 1: 10; e de 9,8 mm na diluiçao 1: 30. Nesta diluiçao1:30 a mediana obtida foi 0 mm, pois alguns testes foram negativos (Tabela 2).

A média das pápulas do extrato B concentrado foi de 12,4 mm; 10,5 mm na diluiçao 1:3; 8,7 mm na diluiçao 1:10; e 5,0 mm na diluiçao 1:30. A mediana obtida com 1:30 foi 6 mm.

A média obtida das pápulas do extrato C concentrado foi de 17,9 mm; na diluiçao 1:3 a média foi 13,7 mm; na diluiçao 1:10 a média foi 11,4 mm; e na diluiçao 1:30 foi 2,4 mm.

As médias obtidas das pápulas com o extrato D foram respectivamente 14,3 mm; 12 mm; 8,7 mm; e 1,3 mm com o concentrado e diluiçoes 1:3, 1:10 e 1:30.

Para o extrato E, as médias das pápulas foram, respectivamente, de 14,6 mm, 12,5 mm, 10,5 mm e 0,98 mm com o concentrado e diluiçoes 1:3, 1:10 e 1:30.

Na comparaçao entre os extratos concentrados, os resultados obtidos foram semelhantes nos extratos A e C. O extrato B, na diluiçao 3, foi diferente dos demais na comparaçao entre os demais extratos. Nas variáveis com distribuiçao simétrica foi utilizado o teste paramétrico Anova. Nas variáveis com distribuiçao assimétrica foi utilizado o teste nao paramétrico Anova de Kruskal-Wallis.

Houve diferenças significativas entre os extratos A, B, C, D e E na comparaçao entre as médias das pápulas obtidas em todas as diluiçoes, mostrando diferença de potência entre os extratos. Ao se comparar a potência dos extratos no segundo dia de teste, o diâmetro médio das pápulas obtidas com o material concentrado, em ordem decrescente de potência foram C > A > E > D > B.

Assim, o extrato C foi o mais potente nos testes cutâneos com extratos concentrados, e o extrato B o menos potente.

Na diluiçao 1:3 a potência se manifestou da seguinte forma em ordem decrescente: C > A > E > D > B. Na diluiçao 1:10 a potência em ordem decrescente foi:C > E > A > D = B.Na diluiçao 1:30 a potência em ordem decrescente foi: B > C > D > E > A.

A média obtida das reaçoes aos testes com histamina 10 mg/mL no primeiro e segundo dias foi de 9,9 mm.

DISCUSSAO

Este estudo se propôs a comparar extratos alergênicos para imunoterapia sublingual comercialmente disponíveis, que em teoria deveriam ter a mesma eficácia na melhora clínica do paciente com sensibilizaçao a alérgenos de gramíneas.

Existe variaçao considerável nos métodos para verificar a potência de extratos alergênicos. Na Europa, a maioria dos fabricantes reporta a potência de um extrato alergênico em unidades baseadas em referência própria, o que dificulta a compreensao da dose exata utilizada. A tendência de alguns fabricantes em expressarem a potência de seus produtos em unidades de massa (microgramas do alérgeno dominante) ainda é unidade arbitrária, e varia com as técnicas empregadas para a determinaçao dos alérgenos²³. A imunoterapia é o único tratamento imunomodulador específico capaz de influenciar a resposta imunológica iniciada pelo alérgeno e restabelecer a imunidade normal, além de ser o único tratamento com objetivo de tratar a causa e nao os sintomas da alergia respiratória²⁴. Baseia-se na administraçao de doses crescentes do alérgeno identificado como causal, visando reduzir a reatividade de pacientes alérgicos^6,25. Tais efeitos culminam na remissao da doença por tempo prolongado, melhora clínica, reduçao da terapia farmacológica e diminuiçao da resposta ao alérgeno nos testes cutâneos de resposta imediata e na provocaçao alergênica específica.

A eficácia da imunoterapia por via sublingual ou subcutânea depende da dose do alérgeno administrada^6,26. A induçao terapêutica de tolerância pode restaurar a imunidade em distúrbios alérgicos e autoimunes. A imunoterapia é um dos melhores exemplos para ilustrar a induçao de tolerância por antígenos externos²⁴.

A padronizaçao dos extratos alergênicos é tema de extrema relevância em alergologia, uma vez que permite ao médico atuante tomar a melhor decisao na escolha do extrato para imunoterapia, de acordo com a sensibilizaçao do paciente^6,24.

A ausência de unidade comum aos extratos disponíveis mundialmente dificulta a adequada comparaçao da potência dos mesmos²⁷.

Os extratos comparados neste estudo sao de apresentaçao líquida e em comprimido de dissoluçao sublingual.

Os resultados obtidos mostraram que há diferença estatisticamente significativa ao se comparar por teste de puntura os extratos alergênicos disponíveis para imunoterapia sublingual. A relaçao entre concentraçao em microgramas de alérgenos por mililitro e diâmetro de reaçao cutânea obtida, nao se aplica, uma vez que nao há informaçoes precisas do método de preparo e obtençao dos extratos. Além disso, conforme se observou, o extrato com maior concentraçao de Phleum pratensepor mililitro -o extrato do FDA, nao apresentou reaçoes proporcionalmente maiores, embora já diluído em 50%.

Na avaliaçao dos extratos, a potência observada pelo teste de puntura com extratos concentrados o mais potente foi Staloral, e o menos potente, Grazax. Resultados obtidos em quadruplicata, no primeiro e segundo dia de testes, e à direita e à esquerda, no dorso dos pacientes. Mostrando dessa forma que há, sim, diferença de potência entre os extratos disponíveis para imunoterapia, mas isto nao indica se poderá gerar uma diferença na resposta clínica individual do paciente.

Essa diferença observada entre os extratos comprova a necessidade de padronizaçao, como no estudo que comparou níveis de alérgenos de Dermatophagoides pteronyssinus(µg/mcL) em extratos de vários fabricantes, e encontrou níveis insuficientes para alcançar doses efetivas preconizadas internacionalmente para imunoterapia efetiva²⁸. É importante a qualidade de extratos alergênicos visando a segurança e eficácia do tratamento imunoterápico. A padronizaçao dos mesmos permite uma reduçao na frequência e gravidade das reaçoes sistêmicas secundárias a imunoterapia.

A variabilidade significativa de potência nos diversos extratos disponíveis na Europa e Estados Unidos da América é inevitável, mas a relevância clínica no tratamento das doenças alérgicas nao foi estabelecida^21,22. O extrato Staloral^®foi o mais potente nos testes cutâneos com extratos concentrados, e o extrato Grazax^®o menos potente. Estes resultados reforçam a necessidade de padronizaçao de extratos alergênicos visando resposta semelhante e confiável, de acordo com a preferência do médico assistente, no tratamento dos pacientes alérgicos em imunoterapia sublingual para alérgenos, especialmente porque essa terapia se encontra em ascensao no Brasil.

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