INTRODUÇÃO

Os fungos têm sido cada vez mais reconhecidos como importantes patógenos em sinusites e doenças das vias aéreas. Eles interagem com células epiteliais aumentando a produção de citocinas e expressão de Toll-like receptors (TLR) mRNA¹. A exposição a certos fungos pode causar doença humana com efeitos adversos para a saúde, através de três mecanismos específicos: a geração de uma resposta imune prejudicial, por exemplo, alergia ou pneumonite de hipersensibilidade; infecção direta pelo organismo; e efeitos tóxicos irritantes a partir de subprodutos do fungo. Para cada um destes mecanismos fisiopatológicos definidos, há doenças humanas relacionadas aos fungos documentadas de forma consistente, que se apresentam com evidência de doença clínica objetiva².

Considerando-se a existência de grande quantidade de fungos alergênicos e a elevada prevalência de alergia, existem poucos estudos determinando a relevância clínica da exposição a alérgenos de fungos³. A estrutura molecular dos alérgenos também desempenha um papel importante na resposta imunológica em pacientes alérgicos. Antígenos podem ter maior ou menor ligação com IgE, e estes podem ter papéis importantes como reagentes específicos ou como imunomoduladores⁴.

As doenças alérgicas representam uma grande ameaça à saúde dos seres humanos. A asma alérgica é uma doença respiratória induzida pela exposição a agentes ambientais que provocam a inflamação alérgica e obstrução transitória das vias aéreas inferiores, e que produz os sintomas característicos de tosse, chiado e dispneia. Antes do advento de modelos experimentais, a asma foi entendida como sendo causada, principalmente, pela degranulação de mastócitos e eosinófilos, desencadeada pela ligação de antígenos a imunoglobulina E (IgE). Estudos subsequentes em camundongos mostraram que células T têm papel central em causar obstrução das vias aéreas antígeno-dependente e inflamação alérgica através da secreção das interleucinas IL-4 e IL-13⁵.

A função da IgE na imunidade não está totalmente esclarecida. A associação de anticorpos com doenças alérgicas foi confirmada pela caracterização da imunoglobulina E (IgE). É comum encontrar IgE elevada também em parasitoses intestinais e cutâneas, imunodeficiências congênitas ou adquiridas, infecções virais e neoplasias⁶. A detecção de anticorpos específicos para fungos tem importância na avaliação da doença alérgica IgE mediada e micose broncopulmonar alérgica. Entretanto, os níveis de anticorpos para fungos não podem ser usados como marcador imunológico para definir dose, tempo e/ou local de exposição à inalação do antígeno fúngico em contexto não infeccioso².

O crescente interesse por micro-organismos alergênicos e a procura de novos indicadores ambientais vêm despertando interesse no estudo de fungos anemófilos no Brasil⁷. O presente estudo teve como objetivos extrair antígenos de Aspergillus spp e Penicillium spp isolados de ambiente externo da cidade de São Luis, Maranhão; detectar níveis de IgE total e IgE específica contra Aspergillus spp e Penicillium spp no soro de crianças diagnosticadas clinicamente com asma e/ou rinite alérgica; correlacionar os níveis de IgE total com IgE específica para entendimento dos processos alérgicos respiratórios causados por fungos em crianças atópicas.

MÉTODOS

Área de pesquisa

A Ilha de São Luís, capital do Estado do Maranhão, Brasil, está localizada no centro do litoral maranhense, com latitude 2º20'00''LS a 2º45'00''LS, longitude 44º01 '21'' LnW a 44º24'54'' LnW. Situa-se ao Norte do Estado, onde se limita com o Oceano Atlântico; ao Sul com o Estreito dos Mosquitos, que a separa do continente; a Leste com a Baía de São José, e a Oeste com a Baía de São Marcos⁸.

CASUÍSTICA

Para calcular o tamanho da amostra foi utilizado o programa Statcalc do software estatístico Epi-Info 3.4.2 (2007). Foram estudadas 98 crianças de ambos os sexos e faixa etária entre 4 e 12 anos, com diagnóstico clínico de alergia respiratória (asma e/ou rinite alérgica), acompanhadas periodicamente no Ambulatório de Alergia da Unidade Materno Infantil da Universidade Federal do Maranhão-UFMA. As crianças estudadas não realizaram testes cutâneos de hipersensibilidade imediata.

Os pacientes do grupo controle eram de ambos os sexos, da mesma faixa etária e os pais foram questionados sobre história de asma e/ou alergia respiratória na família e nas crianças, cuja resposta foi negativa.

Após adesão dos seus pais ou responsáveis ao Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, foram coletados 10 mL de sangue total por punção venosa.

Isolamento e identificação de fungos do ar

A coleta de fungos anemófilos foi realizada em cinco áreas: norte, sul, leste, oeste e centro da cidade de São Luís, Maranhão, Brasil, mensalmente de janeiro a dezembro de 2007, por exposição de placa contendo ágar Sabouraud e coleta espontânea dos esporos^7,9.

Preparo de alérgenos fúngicos

Colônias de Aspergillus e Penicillium foram transportadas para tubo contendo pérolas de vidro previamente esterilizados¹⁰, onde uma parte da massa fúngica e três partes de PBS foi agitada em vortex por cinco minutos, alternando em banho de gelo a cada minuto. A seguir centrifugou-se (Eppendorf 5402, USA) a 20.000 g por 45 minutos a 4 ºC. Utilizou-se o sobrenadante depois de previamente quantificada proteína (BIO-200 BIOPLUS)^11-14.

Ensaio imunoenzimático - ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

IgE total foi detectada por método de ELISA, segundo as instruções do fabricante (Katal Biotecnológica Ind. Com. Ltda., Belo Horizonte-MG, Brasil). As densidades ópticas foram determinadas por espectrometria a 405 nm. Os resultados foram expressos em Índice ELISA (IE) conforme descrito por Alves et al.¹³ Valores de IE acima de 0,301 (IE > 0,301) foram considerados positivos para IgE total, de acordo com dados da literatura e com a média dos valores obtidos no grupo estudado^11-14.

Níveis de IgE específica

Pools das espécies isoladas dos gêneros Aspergillus e Penicillium foram transformados em extrato bruto¹³, e serviram de antígenos sensibilizantes para as placas de ELISA. Placas de fundo plano (Costar^®) foram sensibilizadas com 100 µL de uma solução de antígeno fúngico na concentração de 50 pg/mL e incubadas overnight em geladeira. As placas foram lavadas a seguir por três vezes com tampão PBS Tween 20, pH 7,2, seguida de 2 lavagens com PBS 1×; 100 µL de uma solução bloqueadora - PBS + soro fetal bovino a 10% (eBiosciences, USA) foi adicionada em todos os poços e incubada em estufa a 37 ºC por uma hora. Decorrido o prazo, procedeu-se ao mesmo critério de lavagem, adicionando, a seguir, 100 µL da amostra em duplicata, na diluição 1:2 em PBS 1x. Foi realizada incubação a 37 ºC por uma hora; lavagem e adição de 100 µL do anticorpo secundário (anti-IgE humana com peroxidase - SIGMA) na diluição 1:1000, por 1 hora a 37 ºC. Foi realizada lavagem e adição de 100 µL do substrato TMB-3,3'-5,5'Tetrametilbenzidina (eBiosciences,USA) incubado por 15 minutos em câmara escura. A seguir, colocou-se 100 µL/poço da solução de parada H2SO4 2N. A leitura foi realizada em leitor automático de ELISA, com filtro de 450 nm (Biosystems, USA). Soros de 20 indivíduos sem história clínica de alergia respiratória serviram de controle negativo para os testes de ELISA, sendo dosados os níveis de IgE total, IgE anti-Aspergillus e IgE anti-Penicillium.

As densidades ópticas foram determinadas por espectrometria a 405 nm. Os índices de anticorpos foram expressos em Índice ELISA (IE)¹³ calculados pela expressão:

DOi = média da densidade óptica da amostra teste; DOcontrole = média da densidade óptica de três amostras de soros de indivíduos com ausência de IgE específica (IE < 0,603 para IgE anti-Aspergillus spp, e IE < 0,466 para IgE anti - Penicillium spp) para os antígenos fúngicos de Aspergillus spp e Penicillium spp; δ = desvio padrão das densidades óticas das amostras de soros de indivíduos do grupo não alérgico.

Valores de IE acima de 0,603 (IE > 0,603) foram considerados positivos para IgE anti-Aspergillus spp, e acima de 0,466 (IE > 0,466) para IgE anti-Penicillium spp.

Aspecto ético

O protocolo do estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário da UFMA sob nº 406/06.

RESULTADOS

Foram estudadas 98 crianças com idades entre 4 e 12 anos, de ambos os sexos, com sinais e sintomas de alergia respiratória (asma e/ou rinite alérgica), acompanhadas periodicamente no ambulatório de Alergia da Unidade Materno-Infantil, do Hospital Universitário da Universidade Federal do Maranhão (UFMA). Das crianças estudadas, 65 (66,3%) eram do sexo masculino, e 33 (33,7%) do sexo feminino.

A pesquisa de IgE total revelou que 95 (96,9%) crianças apresentaram nível igual ou superior a IE 0,301, sendo 63 (64,3%) do sexo masculino e 32 (32,7%) do sexo feminino. A correlação entre níveis de IgE total e a área de residência das crianças estudadas (norte, sul, leste, oeste e centro) não apresentou significância estatística (p = 0,88). Analisou-se a correlação entre IgE total e a faixa etária das crianças e verificou-se uma distribuição não normal dos dados, com destaque à faixa etária de 11 anos, onde os níveis de IgE total foram mais elevados (Figura 1).

Figura 1 - Correlação entre faixa etária das crianças estudadas e a concentração de IgE total (densidade ótica), em São Luís, MA, Brasil, 2007
Teste de Shapiro (p < 0,05)

Níveis de IgE específica contra Aspergillus spp foram detectados em 73 (74,5%) crianças deste estudo, sendo 49 (67,1 %) do sexo masculino e 24 (32,9%) do sexo feminino. A correlação entre níveis de IgE anti-Aspergillus e sexo não apresentou significância estatística (p = 0,86). Quanto à área de residência (norte, sul, leste, oeste e centro) correlacionada aos níveis de IgE anti-Aspergillus, não houve significância estatística (p = 0,90). A correlação entre níveis de IgE total e IgE anti-Aspergillus não mostrou significância estatística (p = 0,19; teste de Spearman), conforme Figura 2.

Figura 2 - Correlação entre concentração (densidade ótica) de IgE total e IgE anti-Aspergillus no soro de crianças em São Luís, MA, Brasil, 2007
Correlação de Spearman (p = 0,19)

Níveis de IgE anti-Penicillium foram detectados em 85 (86,7%) crianças deste estudo, sendo 55 (64,7%) do sexo masculino e 30 (35,3%) do sexo feminino. Investigou-se a correlação entre níveis de IgE anti-Penicillium e sexo e não houve significância estatística (p = 0,39), assim como a correlação entre níveis de IgE anti-Penicillium e procedência (p = 0,13). Investigou-se, também, a correlação entre níveis de IgE total e IgE anti-Penicillium. Evidenciou-se pela correlação de Spearman (p = 0,15) que nas crianças estudadas não houve significância estatística entre níveis de IgE total e níveis de IgE específica contra Penicillium (Figura 3).

Figura 3 - Níveis de IgE total e IgE anti-Penicillium, em crianças atópicas de São Luís, MA, Brasil, 2007
Correlação de Spearman (p = 0,15)

DISCUSSÃO

O nível de IgE total no soro varia com a idade e tende a variar em consequência do contato com antígenos, fato comum também às outras classes de imunoglobulinas. Segundo Spalding et al.⁶, o nível de IgE é maior para os indivíduos do sexo masculino em qualquer faixa etária considerada. Nossos resultados corroboram estes autores, pois 64,3% foram do sexo masculino e 32,7% do sexo feminino. Em contrapartida, Baigergenova et al.¹⁴, no Canadá, notificaram que visitas a pronto-socorro por asma predominaram em mulheres (62,2%), e que mulheres apresentaram maior chance de ter internação hospitalar por asma que homens, com odds ratio de 1,64, 95% intervalo de confiança de 1,41 a 1,90.

Não se encontrou correlação entre a procedência dos indivíduos (norte, sul, centro, leste e oeste) e a positividade para IgE total (p=0,781). García Caballero et al.¹⁵, estudando 35 pacientes com alergia respiratória, com idades entre 3 e 16 anos, encontraram, pelo método de ELISA, IgE total elevada em 77,2%. No presente trabalho, detectou-se IgE total em 96,9%.

A quantificação dos níveis séricos de IgE específica é o mais importante método in vitro para o diagnóstico de hipersensibilidade mediada por IgE, contudo menos sensível que os testes cutâneos. O achado de IgE específica contra determinado antígeno indica sensibilização a este, porém, nem sempre significa doença¹⁰.

Os pacientes atópicos (aqueles com asma alérgica, rinite alérgica e dermatite atópica) geralmente têm anticorpos IgE contra fungos como parte da polissensibilização. Reações alérgicas a antígenos de fungos inalados são fatores reconhecidos na doença das vias aéreas inferiores, como a asma, mas os estudos atualmente disponíveis não provam que a exposição aos fungos transportados pelo ar em ambientes externos desempenhe um papel na rinite alérgica².

Os pacientes com suspeita de alergia a fungos devem ser avaliados por meio de testes cutâneos de hipersensibilidade imediata ou método para detecção de anticorpos IgE no sangue contra antígenos fúngicos adequados, como parte da avaliação clínica de potenciais alergias¹⁶.

No presente estudo, detectou-se presença de IgE específica contra Aspergillus spp em 73 (74,5%) crianças. Segundo Coop et al.¹⁷, o gênero Aspergillus pode invadir e se disseminar nos pulmões de asmáticos que estão recebendo altas doses de corticosteroides. Antígenos de Aspergillus têm sido estudados exaustivamente; seus esporos têm sido reconhecidos dentre os primeiros aeroalérgenos importantes nas doenças respiratórias bem como em diversas outras doenças³.

Knutsen et al.¹⁸ fizeram dosagens seriadas de reatividade IgE para antígenos purificados de Aspergillus, principalmente Asp f 3, e demonstraram que o aumento na reatividade IgE pode propiciar uma melhor distinção entre as fases de exacerbação e remissão das alergias respiratórias, em comparação com a reatividade IgE a extrato bruto de Aspergillus.

A avaliação quanto à área de residência (norte, sul, leste, oeste e centro) e níveis de IgE detectados contra Aspergillus não mostrou correlação significante (p = 0,90). Considerando que o gênero Aspergillus foi o mais frequente nesta pesquisa e esteve presente em todas as áreas da cidade, provavelmente, os esporos deste fungo são sensibilizantes naturais das crianças deste estudo.

Dias e Gupta-Bhattacharya¹⁹, na Índia, encontraram reatividade de 10,8 a 54,8% ao teste cutâneo em indivíduos com história clínica de alergia respiratória, quando utilizaram extrato de Aspergillus. Hemmann e al.²⁰ em seus estudos com alérgeno recombinante de Aspergillus fumigatus Asp f 3 demonstraram similaridade deste alérgeno com outras duas proteínas de Candida boidinii. Estas proteínas foram produzidas como proteínas recombinantes em Escherichia coli. De forma interessante, a ligação de IgE a Asp f 3 pode ser inibida com ambas as proteínas homólogas de Candida, sugerindo que esses alérgenos podem ser epítopos comuns ligantes para IgE.

No presente trabalho, não houve correlação significante entre IgE total e IgE anti-Aspergillus, pelo teste de Sperman (p = 0,19). Ter níveis elevados de IgE total não depende, necessariamente, de anticorpos específicos contra Aspergillus spp.

O gênero Penicillium foi o segundo fungo mais isolado no ambiente externo dos pacientes estudados. 85 (86,7%) crianças apresentaram sensibilização a este fungo, sendo 55 (64,7%) do sexo masculino e 30 (35,3%) do feminino. Para Burge et al.²¹, este gênero fúngico pode ocorrer em ambientes externos, embora sua maior importância esteja relacionada a ambientes internos. Asma dos tipos imediata e retardada pode ser induzida em indivíduos sensibilizados com esporos de Penicillium spp ²².

Em extrato de Penicillium notatum foram detectadas onze proteínas de 20 a 90 kDa que funcionam como epítopos ligantes para IgE. As mais importantes proteínas alergênicas foram de 68 e 64 kDa, que reagiram respectivamente com 56% e 46% das amostras de soro de 39 indivíduos²³.

Quanto aos níveis de IgE anti-Penicillium, não houve correlação significante com a área de residência das crianças estudadas (p=0,13), embora este gênero tenha sido o segundo mais isolado em todos os ambientes livres da cidade. Este achado pode sugerir que a sensibilização por Penicillium não dependa da área onde as crianças moram.

Para Hemmann et al.²⁰, aproximadamente 10% da população possui anticorpos IgE para fungos inalantes e cerca de metade desses indivíduos está prevista para, em algum momento, ter sintomas alérgicos como consequência da exposição a alérgenos fúngicos. A aeromicologia, nos últimos anos, tem mostrado a existência de numerosos esporos de fungos anemófilos classificados como bioaerossóis, e sua concentração varia dependendo das condições ambientais²⁴.

Os níveis de IgE total, por não apresentarem correlação significativa com os níveis de IgE anti-Aspergillus spp e anti-Penicillium spp detectados nas crianças estudadas, podem estar relacionados à polissensibilização a estes fungos, uma vez que estes estiveram presentes em todas as áreas e durante todo o ano na cidade de São Luís, Maranhão, Brasil. Essa polissensibilização tem impacto importante em relação aos sintomas de asma e/ou rinite alérgica, podendo desencadear exacerbação dos sintomas. São necessários mais estudos para o entendimento da alergia respiratória por fungos do ar nas crianças estudadas.

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