Introdução

As mudanças na distribuição dos aeroalérgenos ocorrem gradativamente no decorrer do tempo e necessitam de monitoramento a fim de identificar as exposições ambientais dos indivíduos, bem como possíveis novas sensibilizações e desencadeamento de sintomas respiratórios. O surgimento da alergia molecular permitiu identificar com sensibilidade e especificidade o perfil de sensibilização dos indivíduos. Da mesma forma, abriu perspectivas para a compreensão dos alérgenos de cada local, suas concentrações e potenciais exposições das populações^1,2.

Neste contexto, o alérgeno principal da poeira da casca da soja, Gly m 1, passou a ser investigado, particularmente em países da Europa, por estar relacionado a surtos de asma ocorridos nos portos de algumas cidades, relacionados ao descarregamento dos grãos de soja nos silos^3‑7. Com o avanço das pesquisas na área, compreendeu-se que a dispersão do alérgeno estava associada a questões climáticas locais, bem como os aspectos genéticos populacionais^8‑10. Novas estratégias no combate à dispersão deste alérgeno passaram a ser utilizadas nos portos europeus, como colocação de filtros nos silos, o que levou à redução significativa do Gly m 1 na atmosfera e impedindo novos surtos de asma¹¹.

Contudo, apesar da importância do Gly m 1 como aeroalérgeno, os estudos não avançaram na investigação da presença do alérgeno nas áreas de possível dispersão. Na última década não existem levantamentos aerobiológicos deste alérgeno em nenhuma localidade do mundo, apesar deste ser um agente sensibilizante tanto da exposição ocupacional, quanto da exposição indireta^6,7,10,12. No Brasil, Pinto e cols.¹² evidenciaram a sensibilização frequente à soja em trabalhadores e habitantes das áreas produtoras de soja, mas sem realizar avaliações da concentração do alergérno na atmosfera. Em um levantamento piloto de Gly m 1 realizado em 2016 por este grupo, evidenciamos a presença deste alérgeno na atmosfera, o que motivou o avanço do presente estudo¹³.

Métodos

Foram realizadas coletas atmosféricas periódicas de março de 2017 a março de 2018. Para tanto, foram utilizados filtros de fibras de vidro de borosilicato puro (Pallflex^®), de 47 mm de diâmetro, resistentes ao calor, com revestimento de fluorocarbono (tetrafluoroetileno, TFE) resistente à umidade. Durante a amostragem do ar, as variações de umidade no ar ou nos gases não causam reações químicas no filtro.

O amostrador utilizado foi de material particulado total, capaz de captar partículas de tamanhos variados. O amostrador foi colocado na região urbana do município de Maringá-PR, a 23,41^o de latitude sul, 51,97^o de longitude oeste e 537 metros de altitude, em ambiente externo a 90 cm acima do solo. Foram coletadas 70 amostras, de 24 ou 48 horas. A duração de cada coleta baseou-se no estudo piloto realizado, bem como em outros trabalhos que evidenciaram a presença do Gly m 1 em amostras de 24 horas^7,9,10,13. Foram excluídas amostras por problemas técnicos, como queda de energia, chuvas excessivas e tempo de coleta inadequado. Vale frisar que o ponto de coleta dista 2,5 km, em linha reta, da principal cooperativa de beneficiamento de soja da região. Os filtros coletados foram acondicionados à -20 ^oC para posterior análise.

Para o preparo das amostras, os filtros foram cortados em pedaços de 3 cm² e eluídos em solução de NH₄HCO₃ com BSA 1% (albumina sérica bovina a 1%) e Tween 20^® (Polisorbato) à 0,1%, homogeneizados em orbital à temperatura de 4 ºC durante a noite, perfazendo um volume final de 3 mL. Após o processo de eluição, o material foi centrifugado por duas vezes, e realizada a extração do sobrenadante utilizado para análise por meio do ELISA.

O ELISA foi realizado com placas pré-sensibilizadas com anticorpo monoclonal anti-Gly m 1 (ALK-Abello^®), conforme descrito por Gonzalez e cols.⁶. Este método é de alta especificidade com rara possibilidade de reatividade cruzada com outros alérgenos. A placas foram previamente lavadas e as amostras, curva padrão, controles e filtro branco adicionados todos em duplicata. Na sequência, colocado o anticorpo de detecção biotinilado (ALK-Abello^®) acoplado à streptavidina-peroxidase (STAV-PO, Thermo Fisher-Scientific^®). Por fim, a TMB (3,3',5,5'-Tetrametillbenzidina) foi adicionada às placas incubadas em ambiente escuro e a reação interrompida com 4N H₂SO₄. A leitura foi realizada por espectrofotometria entre os comprimentos de onda de 490 a 650 nm, inferindo-se as concentrações.

Os dados metereológicos foram coletados diariamente de março de 2017 a março de 2018 do site do INMET (Instituto Nacional de Metereologia) da estação metereológica de Maringá (OMM:83767, latitude: -23,4; longitude -51,91; altitude: 542 m). Foram eles: temperatura máxima, mínima e média compensada; umidade relativa (UR); precipitação; velocidade e direção do vento e insolação.

Resultados

Foram coletados 70 filtros, durante o período de 12 meses (29 de março de 2017 a 26 de março de 2018). As coletas foram padronizadas em 1 ou 2 dias, com média de 24 horas e 6 minutos ou 48 horas e 20 minutos, respectivamente. O volume de ar amostrado em cada filtro foi, em média, 1,13 m³ de ar por hora. Todos os meses tiveram filtros coletados, com a média e mediana de intervalo entre as coletas de 5 dias. Do total de filtros, 10 deles foram excluídos da análise por coleta inapropriada.

As concentrações de Gly m 1 por ELISA (ng/mL) foram convertidas para ng do alérgeno por m³ de ar por ser esta a unidade de medida mais utilizada. A mediana encontrada foi de 4,89 ng/m³. Todas as amostras apresentaram a presença de Gly m 1, sendo o menor valor encontrado de 0,67 ng/m³, e a maior concentração de 1826,1 ng/m³ (Figura 1).

Figura 1
Concentrações de Gly m 1 em escala logarítmica (Log¹⁰) nas 60 amostras

Os filtros de 24 e 48 horas apresentaram concentrações similares (Mann Whitney; p = 0,32), sendo a mediana dos filtros de 24 horas de 4,4 ng/m³, enquanto que os de 48 horas apresentaram mediana de concentração de 6,3 ng/m³. Da mesma forma, quando feita a análise dos dois grupos, excluindo os valores extremos (outliers), o grupo de 24 horas apresentou mediana de 4,03 ng/m³ e o de 48 horas apresentou mediana de 3,09 ng/m³, evidenciando novamente a homogeneidade entre os grupos (Mann Whitney; p = 0,157). Para o cálculo de outliers, utilizou-se como valores o primeiro quartil de 2,24 e o terceiro quartil 91,4. Os outliers foram todos os valores acima de 225,2 ng/m³, totalizando 52 amostras.

Quanto aos dados metereológicos referentes aos dias de coleta, a temperatura média foi 22,4 ^oC, a UR 68,5%, e insolação de 7,7 horas. Os dados foram similares ao demais dias do ano em que não houve coleta. O mesmo se deu com a intensidade do vento, com média nos dias de coleta de 1,48 m/s, que trata-se de vento tipo aragem. Quanto à direção do vento, houve predomínio nos dias de coletas de vento leste e nordeste. Ressalta-se que a cooperativa encontra-se entre norte e nordeste do ponto de coleta.

Foram verificadas correlações positivas das concentrações de Gly m 1 com os fatores: temperaturas e UR (Tabela 1). As mesmas análises estatísticas feitas excluindo-se os outliers evidenciaram correlações positivas das concentrações de Gly m 1 com temperaturas, UR, insolação e intensidade do vento (Tabela 2).

Discussão

O alérgeno da poeira de soja é capaz de causar sintomas respiratórios comprovados por broncoprovocações^14,15. Contudo, o impacto da presença do Gly m 1 na atmosfera segue incógnito. Baseado nos dados dos surtos ocorridos em Barcelona na década de 90, acredita-se que a alergenicidade à poeira de soja ocorra em 1 a cada 1.700 pessoas¹⁶. Sabidamente, fatores climáticos e particularidades da população interferem nesta sensibilização e certamente na apresentação de sintomas^10,17,18. Ademais, a alergenicidade da casca de soja pode ser afetada pelo aquecimento durante o armazenamento e transporte do grão, o que pode produzir novos determinantes de alérgenos ou aumentar a exposição aos epítopos por mudanças conformacionais¹⁹.

Alguns estudos avaliaram a sensibilização por ELISA para Gly m 1 nas populações portuárias e foram importantes para correlação do alérgeno com os surtos de asma^3,20,21. Codina e cols.²² e Pendino e cols.²³ avaliaram a sensibilização por teste de puntura ao extrato de casca da soja em adultos e crianças, respectivamente, com asma. Ambos evidenciaram sensibilização à casca de soja mesmo em populações sem exposição direta ao grão. Contudo, todos os testados foram polissensibilizados, apresentando reatividade também a ácaros, fungos ou polens.

No Brasil, Pinto e cols.¹² identificaram que indivíduos sintomáticos que habitavam a zona rural em meio a cinturões de soja apresentaram 28% de sensibilização ao grão, por teste cutâneo com extrato total, sendo que 5% deles eram monossensibilizados à soja. Da mesma forma, entre moradores da região fabril e caminhoneiros que transportavam soja, a sensibilização foi elevada (22% para ambos os grupos), mas não exclusiva, ocorrendo também aos ácaros de estocagem e aos fungos que colonizam os grãos. Nota-se, portanto, que há um grupo de indivíduos atópicos, polissensibilizados, e a soja pode ser um sensibilizante adicional neste contexto, em que os ácaros e fungos exercem o papel principal, como protagonistas das manifestações respiratórias alérgicas.

Os níveis de Gly m 1 detectados na atmosfera mostram-se mais elevados nas proximidades dos locais de manuseio da soja. Dosagens realizadas na área portuária foram 12 vezes mais elevadas que a 5 km de distância do porto¹⁰. No presente estudo, o ponto de coleta estava a uma distância intermediária da cooperativa (2,5 km). Apesar de relativa distância, evidenciamos níveis de Gly m 1 detectáveis em todas as amostras coletadas durante os 12 meses. Poeira da casca de soja também pode ser produzida durante os períodos de colheita e em todas as fases de beneficiamento da soja^9,10,24, o que justifica a presença perene do Gly m 1 na atmosfera de Maringá e não somente sazonal. Apesar da colheita ocorrer entre janeiro e março, a cooperativa trabalha no beneficiamento de grãos durante o ano todo.

No presente estudo, identificamos algumas correlações positivas quando tratados os dados de concentração para Log¹⁰ e raiz cúbica. A escolha por realizar essas transformações dos dados se deve à grande dispersão de valores encontrados (de 0,67 ng/m³ a 1826,1 ng/m³). Análises de correlação e regressão são influenciadas com a presença de valores extremos e a transformação dos dados pode reduzir o efeito deste viés. As correlações foram maiores quando retirados os outliers. Observamos correlação positiva das concentrações de Gly m 1 (em raiz cúbica) com as temperaturas (R ≥ 85%), umidade relativa (R = 83%), insolação (R = 79%) e intensidade do vento (R = 74%). Nos modelos de regressão linear univariada utilizando novamente as concentrações tratadas em raiz cúbica obtivemos R² > 70% para as temperaturas e R² = 69% para umidade relativa. De forma similar, na avaliação realizada em Ancona, Antonicelli e cols.¹⁰ observaram no modelo de regressão linear multivariada que as concentrações de Gly m 1 sofreram influências dos fatores temperatura e umidade relativa do ar.

Alta pressão atmosférica, ventos calmos e a direção do vento foram fatores possivelmente associados à maior dispersão do alérgeno Gly m 1^25,26. No presente estudo, houve correlação positiva da intensidade do vento com as concentrações. Contudo, durante todos os dias analisados, a intensidade do vento foi considerada calma, variando de aragem a brisa leve. Isto pode ter sido um fator de contribuição para a dispersão constante do alérgeno. Quanto à direção do vento, não evidenciamos correlação com as concentrações, contudo houve predomínio de ventos favoravelmente da cooperativa para o ponto de coleta, o que pode ter favorecido a presença diária de níveis detectáveis do Gly m 1.

Embora haja controvérsia acerca dos valores de Gly m 1 capazes de desencadear sintomas, no presente estudo, alguns valores foram elevados. Das 60 amostras analisadas, em 14 (23%) foram encontrados valores maiores que 90 ng/m³, com pico de 1826 ng/m³ no mês de março de 2018. Destaca-se que em quase todos os meses encontramos ao menos uma dosagem superior a 90 ng/m³, com exceção dos meses de setembro 2017 e janeiro 2018, cujas concentrações mensais foram as mais baixas, variando de 1,09 - 2,85 ng/m³ e 0,66-13,9 ng/m³, respectivamente. Em contrapartida, nos meses de junho 2017 e março de 2018 foram detectados os maiores níveis de Gly m 1. Em junho de 2017 os valores variaram de 1,98 a 1549 ng/m³ (mediana 303,44 ng/m³), e em março de 2018 houve variação de 6,35 a 1826 ng/m³ (mediana de 428 ng/m³).

Os baixos níveis encontrados em janeiro podem ser atribuídos à precipitação, que foi intensa neste mês, com média de 21 mm nos dias de coleta, como visto em outros estudos⁹. Valores mais elevados em março de 2018 coincidiram com o período de colheita da soja. Gijzen e cols.⁹ também observaram que os picos dos níveis de Gly m 1 se deram durante o mês de colheita (atingindo 73 ng/m³). A presença de campos de cultivo nas proximidades, bem como a forma de colheita realizada, podem influenciar nos níveis encontrados.

Algumas limitações devem ser ressaltadas neste estudo. As coletas foram realizadas em um único local da cidade e refletem apenas aquele ponto. A altura de coleta foi a apenas 90 cm do solo, o que poderia influenciar negativamente a amostragem devido a anteparos próximos. Os dias de coleta foram escolhidos por conveniência. Dias muitos chuvosos eram automaticamente descartados pela impossibilidade de expor o aparelho a chuvas mais intensas. Particularmente as coletas de 48 horas podem ter apresentado perdas com relação ao material proteico por ficarem muito tempo expostas, em temperaturas médias elevadas. Contudo os grupos 24 horas e 48 horas evidenciaram similaridade nas concentrações. Além disso, os dados climáticos são fornecidos apenas de forma pontual (2 ou 3 horários do dia) e avaliados por média.

Os presentes achados de Gly m 1 precisam ser melhor explorados. A avaliação por meio de ELISA para Gly m 1 dos indivíduos com sensibilização documentada à soja (por teste cutâneo ou IgE específica) poderia esclarecer a real sensibilização desta população, se esta se dá por meio alimentar, respiratório ou ambos. Outro ponto a ser considerado e investigado é se indivíduos sensibilizados por via respiratória poderiam ter sintomas alimentares à soja, e vice-versa. A realização de testes de provocação nasal, ocular ou brônquica com o alérgeno da soja pode esclarecer qual o verdadeiro impacto da dispersão do Gly m 1 na atmosfera sobre os indivíduos sensibilizados à soja²⁷.

Apesar das limitações apresentadas, o estudo foi inovador por realizar pela primeira vez análises ambientais de alérgenos da poeira da casca da soja no Brasil. Os estudos de aeroalérgenos ambientais são fundamentais para o conhecimento do alergista, possibilitando entender o meio ao qual o seu paciente é exposto, identificando os riscos, realizando prevenção e permitindo tratamento personalizado. Em termos de saúde pública, o conhecimento dessas exposições permite ao alergista atuar de forma conjunta com outros profissionais (biólogos, ambientalistas e engenheiros ambientais), pois fortalece e fomenta as discussões no âmbito político acerca das mudanças climáticas, poluição, emissão de gases e monitoramentos aerobiológicos de todos os tipos.

Agradecimentos

Agradecemos ao laboratório ALK-Abelló^® (Madri-Espanha) que gentilmente cedeu os kits de ELISA para Gly m 1 para que as análises do presente estudo pudessem ser realizadas.

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