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Revista oficial da Associação Brasileira de Alergia e Imunologia ASBAI

Brazilian Journal of Allergy and Immunology (BJAI)

Número Atual:  Janeiro-Março 2018 - Volume 2  - Número 1


Artigo Original

Determinação da potência relativa de extratos alergênicos de Phleum pratense por testes cutâneos

Establishing the relative potency of Phleum pratense allergenic extracts using skin prick tests

Nelson A. Rosario Filho1; Elizabeth M. Mercer Mourão1; Alessandra dos Santos Bitencourt1; Cristine S. Rosario1; Désirée E.S. Larenas Linnemann2


1. Serviço de Medicina Respiratória Pediátrica, Complexo Hospital de Clínicas, Universidade Federal do Paraná - Curitiba, PR, Brasil
2. Hospital Medica Sur - México, D.F., México


Endereço para correspondência:

Nelson A. Rosario Filho
E-mail: nelson.rosario@ufpr.br


Submetido em: 23/02/2018
Aceito em 26/02/2018

Não foram declarados conflitos de interesse associados à publicação deste artigo.

RESUMO

OBJETIVOS: Comparar a potência de extratos europeus de Phleum pratensepara imunoterapia sublingual (ITSL), em relação ao extrato referência norte-americano.
MÉTODOS: Foram selecionados 15 sujeitos, com idade entre 18 e 55 anos, histórico clínico sazonal compatível e teste cutâneo com alta reatividade a gramíneas. O delineamento de estudo foi transversal, triplo cego e randômico, e comparadas as potências dos seguintes extratos alergênicos para ITSL: (A) Soluprick®(30 HEP/mL) e (B) Grazax®75.000 SQ-T, ambos os extratos da ALK-Abelló; (C) Oralair®e (D) Staloral®, com 300 IR/mL, Stallergènes, França. O extrato de origem norteamericana (E) foi o padrão, contendo 10.000 BAU/mL. Todos os extratos foram usados em forma de concentrados e nas diluições 1:3, 1:10, e 1:30. Os testes foram aplicados em quadruplicata em dois dias não consecutivos. Os diâmetros de pápula e eritema foram registrados após 15 minutos.
RESULTADOS: Não houve diferença significativa entre os testes realizados no primeiro e segundo dias (p = 0,37) com extratos concentrados, na diluição 1:3 e também 1:10 (p = 0,20 e p = 0,33, respectivamente). No segundo dia de testes, a média obtida das pápulas do extrato A foi de 16,7 mm na diluição 1:3; de 14,3 mm na diluição 1:10; e de 9,8 mm na diluição 1:30. Houve diferenças significativas entre os extratos A, B, C, D e E na comparação entre as médias das pápulas obtidas em todas as diluições, mostrando diferença de potência entre os extratos. O diâmetro das pápulas obtidas com o material concentrado, em ordem decrescente de potência, foram C > A > E > D > B. As reações observadas com extratos concentrados mostrou que o mais potente foi Staloral, e o menos potente Grazax.
CONCLUSÕES: Houve variabilidade significativa de potência nos diversos extratos comparados. Isto reforça a necessidade de padronização de extratos alergênicos para ITSL.

Palavras-chave: Imunoterapia com alérgenos, alérgenos, alergia a pólen.




INTRODUÇÃO

As manifestações clínicas da alergia ao pólen podem ocorrer durante todo o ano ou durante a primavera, época de polinização mais intensa. No Sul do Brasil, a polinização de gramíneas inicia em setembro e pode se estender até janeiro. As variações climáticas e o índice de precipitação pluviométrica controlam a época de polinização e a carga atmosférica do pólen, resultando em modificações na intensidade e no início dos sintomas em cada estação1,2. Várias espécies de gramíneas produtoras de pólen têm sido reconhecidas como alergênicas, entre elas, Lolium perenne, Poa pratensis, Phleum pratense, Dactylis glomerata e Cynodon dactylon2,3.

Lolium multiflorum, gramínea conhecida como azevém, é a principal causadora de polinose na região Sul do Brasil4,5. Estudos imunológicos indicam que há até 95% de homologia antigênica entre as gramíneas Lolium multiflorume Phleum pratense. Phleum pratenseé uma gramínea de relevância alergênica em regiões de clima temperado. Entre seus alérgenos se destacam: Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5 e Phl p 6. Os grupos 1 e 5, são os mais prevalentes na sensibilização de pacientes3.

Imunoterapia específica para alérgenos é o único tratamento disponível que pode limitar a progressão das doenças alérgicas e prevenir o surgimento de novas sensibilizações alérgicas6-8.

Os testes cutâneos de leitura imediata, por puntura ou intradérmicos, são usados há décadas como forma de identificar a presença de anticorpos IgE específicos para alérgenos9. São altamente sensíveis para diagnóstico das doenças atópicas com rapidez e reprodutibilidade10.11. Testes cutâneos por puntura ou intradérmicos em indivíduos conhecidamente alérgicos foram ambos validados para avaliar a potência biológica dos extratos de imunoterapia, e ainda permitir a comparação da potência de extratos de diferentes fabricantes12-16.

Extratos alergênicos são produzidos para diagnóstico e tratamento de doenças mediadas por IgE. Esses extratos são constituídos por complexos de materiais biológicos17-19. A padronização é o processo de avaliação da potência de determinado extrato, comparando-o a amostras de referência com quantidades conhecidas de alérgenos específicos16,20. Embora seja altamente desejável, nem todos os extratos utilizados na prática clínica são padronizados, nesse caso cada produtor deve ter seu controle interno para assegurar um nível aceitável de comparação a cada novo lote preparado19,21.

Os objetivos deste estudo são comparar em testes de puntura as potências de extratos europeus de Phleum pratenseem relação ao extrato de referência do FDA (Food and Drug Administration) dos Estados Unidos da América.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Para documentar a potência relativa em testes cutâneos de extratos alergênicos de Phleum pratensede diferentes fabricantes, o delineamento selecionado foi um ensaio clínico de superioridade de potência, com a finalidade de avaliar um dos pilares do tratamento com extratos alergênicos. O estudo foi triplo cego, randômico, multicêntrico e internacional. Os dados gerados neste Serviço foram analisados interinamente. Os participantes foram recrutados através de notificação eletrônica via intranet (sistema eletrônico do Complexo Hospital de Clínicas - UFPR), e que tivessem sintomas típicos de rinoconjuntivite alérgica durante o período da primavera.

Foram selecionados os sujeitos de qualquer sexo ou raça, com idade entre 18 e 55 anos, com histórico clínico sazonal compatível com possível alergia ao pólen e confirmada por resultado positivo para teste de puntura (diâmetro médio de pápula de 8 mm) para Phleum pratensecom extrato contendo 10.000 AU/mL, Greer Laboratories, EUA. Nenhum dos sujeitos havia usado medicação nos últimos 15 dias que pudesse interferir com os resultados de testes cutâneos.

Os critérios de exclusão foram os seguintes: espirometria com volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1) abaixo de 80% do valor normal previsto; gravidez ou pacientes femininos sem prática contraceptiva aceitável; pacientes com histórico de anafilaxia ou reações alérgicas graves; necessidade de anti-histamínicos para controlar sintomas; administração de corticoide nos últimos 15 dias, ou de ação prolongada nos últimos 90 dias; portadores de dermatite atópica ativa; hiperreatividade cutânea - controle negativo superior a 3 mm de diâmetro ou tendência a urticária; pacientes em vigência de imunoterapia ou com história de realizá-la nos últimos 5 anos.

Testes cutâneos foram realizados na região dorsal de 15 pacientes alérgicos, selecionados conforme critérios de inclusão e exclusão, por história clínica sugestiva de alergia a Loliume teste cutâneo de puntura com alta reatividade a este alérgeno.

O dispositivo usado para puntura foi lanceta de aço inoxidável, calibrada e descartável Alk Lancet®.

Extratos alergênicos

Para reduzir esta diferença em potência, o concentrado de extrato dos Estados Unidos da América foi diluído em 50%, portanto, o concentrado de extrato americano de Phleum pratenseteria 5.000 BAU/mL. Através de testes de puntura foram comparadas as potências dos seguintes extratos alergênicos para imunoterapia sublingual: (A) Soluprick®(30 HEP/mL), e (B) Grazax®75.000 SQ-T, ambos os extratos feitos da mesma matéria prima da ALK-Abelló; (C) Staloral®e (D) Oralair®, com 300 IR/mL, Stallergènes, França. O extrato de origem norte-americana (E) é o padrão Center for Biologics Evaluation and Research/Food and Drug Administration USA, CBER/FDA de 10.000 BAU/mL.

A quantidade de antígeno Phl p 5 em microgramas por mililitro de cada extrato alergênico é de uma publicação prévia: 15 µg em Grazax®; 8,4 µg em Staloral®; 5,2 µg em Oralair®; 9,2 µg em Soluprick®, e 64 µg no extrato original do FDA22.

O diluente utilizado foi glicerina 50%, fornecido por Greer Laboratories®. Os extratos de pólen de Phleum pratenseforam testados em duplicata em cada sessão de testes cutâneos por paciente, portanto, em resultado quádruplo. As formulações em comprimidos foram dissolvidas no mesmo diluente glicerinado. Para os testes por puntura todos os extratos foram usados em forma de concentrados, e nas diluições 1:3, 1:10, e 1:30.

Os extratos alergênicos de Phleum pratensede diferentes fontes e diluições foram selecionados de forma cega e aplicados em lados opostos do dorso do indivíduo. Os frascos de concentrados identificados com as letras A-E e os controles negativos e positivos foram mantidos em códigos, e revelados apenas ao final do estudo.

Testes cutâneos

Para obter resultados mais confiáveis, antes de iniciar os testes de puntura com os extratos em estudo, o técnico designado para aplicação dos testes foi submetido a treinamento. O teste de proficiência consistiu na aplicação alternada de histamina e solução salina no antebraço do paciente. Ambas, histamina e salina foram aplicadas 10 vezes, e a média do diâmetro das pápulas usadas para calcular o coeficiente de variação, que não deveria ser superior a 20%. O teste foi repetido até o aplicador ser aprovado.

Os testes de puntura para cada extrato, concentrados e diluídos, foram aplicados em quadruplicata - dois lados do dorso, em dois dias não consecutivos. O aplicador do teste soube somente quais eram os controles positivos e negativos, assim como os frascos com os concentrados. Além disso, o controle negativo foi usado para confirmar a reatividade da pele do paciente, conforme descrito nos critérios de inclusão.

Os resultados foram avaliados após 15 minutos pelo contorno da pápula e eritema com caneta porosa e transferidos com adesivo transparente para uma folha branca de papel. Esse método, utilizando a fita adesiva, é padrão ouro no registro de testes cutâneos, utilizado em diversos estudos.

Após 7 a 15 dias, durante a segunda sessão, a mesma rotina foi estabelecida e o teste foi repetido, para conseguir o total de quatro repetições.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná, e os participantes, após informação sobre o protocolo, assinaram Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.

 

RESULTADOS

Foram analisados testes cutâneos por puntura de 15 pacientes, com idade entre 18-48 anos e história clínica compatível com rinoconjuntivite alérgica sazonal ao pólen de gramíneas. Esses pacientes realizaram duas visitas ao serviço de referência e foram submetidos a testes no dorso à esquerda e à direita, com padrão em duplicata, dos extratos analisados em suas diluições padronizadas.

Os dados obtidos foram submetidos à mensuração manual, em régua milimetrada, por um único examinador. Foram avaliadas média, desvio padrão, mediana e intervalo de confiança de todos os dados, descritos nas Tabelas 1 e 2. Considerou-se resultado estatisticamente significativo para o valor obtido de p < 0,05. Não houve diferença significativa entre os testes realizados no primeiro e segundo dias (p = 0,37) na comparação dos diâmetros médios das pápulas obtidas com extratos concentrados, na diluição 1:3 e também 1:10 (respectivamente p = 0,20 e p = 0,33). Para comparação entre os extratos na diluição 1:30, foi utilizado o teste de Wilcoxon, e tampouco revelou diferenças significativas nos valores dos diâmetros médios das pápulas (p = 0,30). Não houve diferença entre os testes realizados no dorso à direita e à esquerda, pelo teste Anova (p = 0,97).

 

 

 

 

No segundo dia de testes, a média obtida das pápulas do extrato A concentrado foi de 16,7 mm na diluição 1:3; de 14,3 mm na diluição 1: 10; e de 9,8 mm na diluição 1: 30. Nesta diluição1:30 a mediana obtida foi 0 mm, pois alguns testes foram negativos (Tabela 2).

A média das pápulas do extrato B concentrado foi de 12,4 mm; 10,5 mm na diluição 1:3; 8,7 mm na diluição 1:10; e 5,0 mm na diluição 1:30. A mediana obtida com 1:30 foi 6 mm.

A média obtida das pápulas do extrato C concentrado foi de 17,9 mm; na diluição 1:3 a média foi 13,7 mm; na diluição 1:10 a média foi 11,4 mm; e na diluição 1:30 foi 2,4 mm.

As médias obtidas das pápulas com o extrato D foram respectivamente 14,3 mm; 12 mm; 8,7 mm; e 1,3 mm com o concentrado e diluições 1:3, 1:10 e 1:30.

Para o extrato E, as médias das pápulas foram, respectivamente, de 14,6 mm, 12,5 mm, 10,5 mm e 0,98 mm com o concentrado e diluições 1:3, 1:10 e 1:30.

Na comparação entre os extratos concentrados, os resultados obtidos foram semelhantes nos extratos A e C. O extrato B, na diluição 3, foi diferente dos demais na comparação entre os demais extratos. Nas variáveis com distribuição simétrica foi utilizado o teste paramétrico Anova. Nas variáveis com distribuição assimétrica foi utilizado o teste não paramétrico Anova de Kruskal-Wallis.

Houve diferenças significativas entre os extratos A, B, C, D e E na comparação entre as médias das pápulas obtidas em todas as diluições, mostrando diferença de potência entre os extratos. Ao se comparar a potência dos extratos no segundo dia de teste, o diâmetro médio das pápulas obtidas com o material concentrado, em ordem decrescente de potência foram C > A > E > D > B.

Assim, o extrato C foi o mais potente nos testes cutâneos com extratos concentrados, e o extrato B o menos potente.

Na diluição 1:3 a potência se manifestou da seguinte forma em ordem decrescente: C > A > E > D > B. Na diluição 1:10 a potência em ordem decrescente foi:C > E > A > D = B.Na diluição 1:30 a potência em ordem decrescente foi: B > C > D > E > A.

A média obtida das reações aos testes com histamina 10 mg/mL no primeiro e segundo dias foi de 9,9 mm.

 

DISCUSSÃO

Este estudo se propôs a comparar extratos alergênicos para imunoterapia sublingual comercialmente disponíveis, que em teoria deveriam ter a mesma eficácia na melhora clínica do paciente com sensibilização a alérgenos de gramíneas.

Existe variação considerável nos métodos para verificar a potência de extratos alergênicos. Na Europa, a maioria dos fabricantes reporta a potência de um extrato alergênico em unidades baseadas em referência própria, o que dificulta a compreensão da dose exata utilizada. A tendência de alguns fabricantes em expressarem a potência de seus produtos em unidades de massa (microgramas do alérgeno dominante) ainda é unidade arbitrária, e varia com as técnicas empregadas para a determinação dos alérgenos23. A imunoterapia é o único tratamento imunomodulador específico capaz de influenciar a resposta imunológica iniciada pelo alérgeno e restabelecer a imunidade normal, além de ser o único tratamento com objetivo de tratar a causa e não os sintomas da alergia respiratória24. Baseia-se na administração de doses crescentes do alérgeno identificado como causal, visando reduzir a reatividade de pacientes alérgicos6,25. Tais efeitos culminam na remissão da doença por tempo prolongado, melhora clínica, redução da terapia farmacológica e diminuição da resposta ao alérgeno nos testes cutâneos de resposta imediata e na provocação alergênica específica.

A eficácia da imunoterapia por via sublingual ou subcutânea depende da dose do alérgeno administrada6,26. A indução terapêutica de tolerância pode restaurar a imunidade em distúrbios alérgicos e autoimunes. A imunoterapia é um dos melhores exemplos para ilustrar a indução de tolerância por antígenos externos24.

A padronização dos extratos alergênicos é tema de extrema relevância em alergologia, uma vez que permite ao médico atuante tomar a melhor decisão na escolha do extrato para imunoterapia, de acordo com a sensibilização do paciente6,24.

A ausência de unidade comum aos extratos disponíveis mundialmente dificulta a adequada comparação da potência dos mesmos27.

Os extratos comparados neste estudo são de apresentação líquida e em comprimido de dissolução sublingual.

Os resultados obtidos mostraram que há diferença estatisticamente significativa ao se comparar por teste de puntura os extratos alergênicos disponíveis para imunoterapia sublingual. A relação entre concentração em microgramas de alérgenos por mililitro e diâmetro de reação cutânea obtida, não se aplica, uma vez que não há informações precisas do método de preparo e obtenção dos extratos. Além disso, conforme se observou, o extrato com maior concentração de Phleum pratensepor mililitro -o extrato do FDA, não apresentou reações proporcionalmente maiores, embora já diluído em 50%.

Na avaliação dos extratos, a potência observada pelo teste de puntura com extratos concentrados o mais potente foi Staloral, e o menos potente, Grazax. Resultados obtidos em quadruplicata, no primeiro e segundo dia de testes, e à direita e à esquerda, no dorso dos pacientes. Mostrando dessa forma que há, sim, diferença de potência entre os extratos disponíveis para imunoterapia, mas isto não indica se poderá gerar uma diferença na resposta clínica individual do paciente.

Essa diferença observada entre os extratos comprova a necessidade de padronização, como no estudo que comparou níveis de alérgenos de Dermatophagoides pteronyssinus(µg/mcL) em extratos de vários fabricantes, e encontrou níveis insuficientes para alcançar doses efetivas preconizadas internacionalmente para imunoterapia efetiva28. É importante a qualidade de extratos alergênicos visando a segurança e eficácia do tratamento imunoterápico. A padronização dos mesmos permite uma redução na frequência e gravidade das reações sistêmicas secundárias a imunoterapia.

A variabilidade significativa de potência nos diversos extratos disponíveis na Europa e Estados Unidos da América é inevitável, mas a relevância clínica no tratamento das doenças alérgicas não foi estabelecida21,22. O extrato Staloral®foi o mais potente nos testes cutâneos com extratos concentrados, e o extrato Grazax®o menos potente. Estes resultados reforçam a necessidade de padronização de extratos alergênicos visando resposta semelhante e confiável, de acordo com a preferência do médico assistente, no tratamento dos pacientes alérgicos em imunoterapia sublingual para alérgenos, especialmente porque essa terapia se encontra em ascensão no Brasil.

 

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