INTRODUÇÃO

Lalezari e cols. descreveram em 1960 um caso clínico onde a presença de anticorpos maternos foi responsável por severa neutropenia e quadro clínico infeccioso em 3 de 4 irmãos recém-nascidos. Denominou essa doença de Neutropenia Isoimune Neonatal (NIN). Nesse relato, a primeira criança faleceu de pneumonia, a segunda não foi afetada, a terceira apresentou infecção severa do escalpo e sepse no oitavo dia pós-parto. Essa foi tratada com antibióticos e a contagem de neutrófilos normalizou após 70 dias. A última criança teve onfalite no oitavo dia pós-parto. Nos casos acima, a contagem de neutrófilos não responderam aos corticosteroides, normalizando após 71 dias, sendo interessante que a monocitose compensou a neutropenia. O fato do pai ser heterozigoto para o antígeno responsável pelo estímulo à produção de anticorpos explica geneticamente o segundo filho não afetado¹. A seguir, diversos artigos confirmaram a presença desses anticorpos anti-neutrófilos, relacionando-os definitivamente com infecções que acometem os recém-nascidos^2,3.

A neutropenia aloimune neonatal (NAN) acontece em 0,1% a 0,8% dos nascimentos, sendo caracterizada por neutropenia com cerca de 500 células por microlitro de sangue⁴. Essa condição é resolvida espontaneamente em 8 semanas após o nascimento, podendo persistir por 28 semanas. O limite inferior do número de neutrófilos no sangue de recém-nascidos saudáveis de duas semanas até um ano de idade é de 1.000/µL.

O sistema genético próprio da superfície dos neutrófilos é conhecido como HNA (human neutrophil antigens). O sistema HNA apresenta os seguintes epítopos: HNA-1a, HNA-1b, HNA-1c, HNA-1d; HNA-2, HNA-3a, HNA-3b; HNA-4a, HNA-4b; HNA-5a; HNA5b^5,6. O sistema HLA (human leucocyte antigens) também está presente nessas células, assim como nos linfócitos, plaquetas e outras células nucleadas. O HLA está dividido em genes de classe I (locos A, B e C) e genes de classe II (locos DR, DQ e DP), sendo que a expressão nos neutrófilos acontece especialmente com os antígenos HLA de classe I⁷.

O antígeno HNA que mais ocasiona casos de NAN é o HNA-1a, seguido de outros^8-11. Casos de anticorpos anti-HLA de classe I foram também responsabilizados pela trombocitopenia e neutropenia neonatal^12,13, embora sejam pouco relacionados com essa última patologia.

Os anticorpos anti-HNA e anti-HLA podem resultar da sensibilização materna contra antígenos HNA e HLA paternos presentes nos fetos e ausentes na mãe. Esses anticorpos IgG ultrapassam a barreira placentária, destruindo as células maduras e inibindo a granulocitopoiese. Casos de NAN podem ocorrer já na primeira gestação.

A frequência da aloimunização materna contra antígenos HNA é 4,3%, e de 42,3% contra HLA. No entanto, se houver concomitantemente aloimunização contra antígenos de grupos sanguíneos, a frequência de anti-HNA chega a 7,5% e anti-HLA a 50,3%. O antígeno HNA-1a aparentemente é mais imunogênico, embora não seja o mais frequente¹⁴.

DESCRIÇÃO DO CASO

No presente caso, gêmeas idênticas nasceram por cesárea, com 35 semanas, peso gemelar 1 (G1) 2.125 g e gemelar 2 (G2) 1.605 g, escore de Apgar 8 e 9 nos primeiro e quinto minutos de vida, respectivamente. Posteriormente apresentaram discreta hipertermia e um hemograma evidenciou neutropenia (G1 = 113 mm³ e G2 = 93 mm³). Foram repetidos os exames com piora da neutropenia (G1 = 80 mm³ e G2 = 54 mm³), tendo sido iniciada Filgrastim (Granulokine^®) com melhora da neutropenia (G1 = 1.190 mm³ e G2 = 1.543 mm³). Essa foi a segunda gestação dessa mãe. A neutropenia é considerada grave em recém-nascidos quando houver redução do número de neutrófilos abaixo de 500 neutrófilos/mm³ de sangue¹⁵.

Três dias após, a G1 evoluiu com sintomatologia gastrointestinal, distensão abdominal e vômitos, associadas à leucopenia e neutropenia (910 neutrófilos/ mm³). Não foi observada linfopenia ou trombocitopenia. Considerando a neutropenia e as manifestações intestinais, antibioticoterapia foi iniciada, associada a nova dose de Filgrastim. Dois dias após a evolução de sepse da G1, a G2 evoluiu com os mesmos sintomas e alterações laboratoriais (392 neutrófilos/mm³), sendo realizada a mesma conduta terapêutica. As duas evoluíram bem, houve aumento de peso e normalização dos neutrófilos. As opções terapêuticas, além dos antibióticos são os corticosteroides, imunoglobulina endovenosa e especialmente o fator estimulador de colônias de granulócitos (Granulokine^®).

DISCUSSÃO

A investigação do caso incluiu testes sorológicos e moleculares voltados à detecção de antígenos e anticorpos anti-HNA e HLA.

Prova cruzada por citometria de fluxo

O diagnóstico é fundamental para uma boa avaliação e terapêutica adequada. A prova cruzada por citometria de fluxo, também conhecida por teste de imunofluorescência de granulócitos (GIFT) permite à detecção de anticorpos anti-neutrófilos, anti-linfocitários e anti-plaquetas num mesmo procedimento. O soro materno é incubado com o sangue do recém-nascido e/ou de seu pai, com o objetivo de detectar ou não a reação com os antígenos HNA ou HLA existentes na superfície das células. Anticorpos fluorescentes anti-IgG humana de origem caprina são adicionados posteriormente, permitindo que o laser do citômetro de fluxo identifique as células positivas (fluorescentes), ou seja, que apresentam IgG materna sensibilizando os granulócitos, plaquetas ou linfócitos. Como a forma e a granularidade dessas células são diferentes, é possível distinguir as mesmas pelo citômetro de fluxo, assim como identifica a intensidade média de fluorescência por canal de fluorescência (MCF) em cada tipo celular¹⁶.

Resumidamente, os granulócitos e linfócitos foram isolados do plasma por gradiente de densidade com Ficoll. Após a lise dos eritrócitos com o tampão (BD Pharm Lyse-Becton/Dickinson, São José, CA, USA), a suspensão celular foi lavada duas vezes com PBS suspensão de 25 µL de leucócitos foi incubada com 50 µL do soro materno por 15 minutos na temperatura ambiente. Após 4 lavagens com PBS contendo soro fetal bovino a 2%, as células foram incubadas com o reagente fluorescente (FITC), anti-human IgG (fragment F(ab´)2 (Jackson Immuno Research, USA) na diluição recomendada. Após 10 minutos na temperatura ambiente, as células foram resuspensas em PBS com soro fetal bovino no volume final de 200 µL. As análises foram realizadas no instrumento FACS Canto II (Becton-Dickson, San Jose, CA, USA), utilizando-se o software FACS DIVA v. 6.1.3. Granulócitos e linfócitos foram analisados separadamente, considerando suas características de tamanho e complexidade. A fluorescência mediana por canal (MCF) anti-IgG FITC do soro teste materno foi subtraída do valor da fluorescência do soro controle negativo, obtendo-se o desvio médio de canal (MCS). Em nosso laboratório o cutoff do MCS é ≥ 63 canais.

Os resultados da prova cruzada foram positivos para as filhas G1 e G2, tanto nos granulócitos (MCS = 361 e 372), quanto nos linfócitos (MCS = 491 e 496). Em relação às células do marido, também se observou prova cruzada positiva para granulócitos (MCS = 327) e linfócitos (MCS = 378) (Figura 1).

Figura 1. Prova cruzada por citometria de fluxo entre o soro da mãe e as células de uma das gêmeas (G1) e do pai. As imagens superiores mostram os linfócitos e as inferiores os granulócitos. Os histogramas que demostram a ausência de anticorpos no controle negativo estão à esquerda. O deslocamento da curva para a direita (maior fluorescência) nas outras imagens mostra que o soro da mãe tem anticorpos contra os linfócitos e granulócitos da filha e do pai, respectivamente. O resultado está expresso em MCS (median channel shift).

Teste de aglutinação de granulócitos (GAT)

Realizamos também o teste de aglutinação de granulócitos (GAT), utilizando-se o soro materno e os granulócitos de doadores fidelizados e com seus antígenos HNA1-5 conhecidos. O GAT foi realizado de acordo com protocolo descrito anteriormente com mínimas modificações¹⁷. Resumidamente, os neutrófilos foram isolados com dextran, sendo que 2 µL da suspensão de 5 x 10³ neutrófilos/µL foram incubados em placas de Terasaki com 6 µL de soro da mãe, além de soro controle negativo e positivo, durante 2 horas a 37 ºC. O teste foi realizado em duplicata com 3 doadores de neutrófilos, previamente genotipados para o sistema HNA. Os resultados foram considerados positivos na presença de aglutinação avaliada por microscopia invertida. O soro materno foi positivo com os três doadores que compunham o painel de granulócitos e com uma positividade de 3 e 4+ (Tabela 1).

Anticorpos anti-HLA e anti-HPA

A pesquisa de anticorpos, utilizando microesferas sensibilizadas com antígenos HLA e HNA recombinantes, foi realizada por intermédio do instrumento Luminex^® 100, utilizando reagentes LABScreen Multi e Labscreen Single Antigen (One Lambda Inc), conforme orientação do fabricante. Os testes permitem identificar qualitativa e quantitativamente a reatividade do soro materno contra os antígenos HNA e HLA. A análise dos resultados foi realizada pelo software Fusion 4.2 TM (One Lambda, Inc,).

Os resultados são oferecidos em MFI ou intensidade média de fluorescência. Foram observados 76% de anticorpos contra o painel de antígenos de classe I, e 99% contra o painel de classe II.

Os seguintes anticorpos anti-HLA de classe I foram detectados no soro materno (intensidade de fluorescência maior de 2.000): A1, A24, A25, A32, A80, B13, B15(63), B27, B35, B46, B50, B49, B53, B56, B57, B58, B62, B71, B76, Cw5, Cw8. O soro materno também apresentou anticorpos fortemente reativos contra o antígeno HNA-1a.

Genotipagem HLA de classe I

Foi utilizado o método de Sequence-specific Oligonucleotide (SSO) com o kit LabType, (One Lambda, Inc.) para tipagem HLA da mãe, do pai e dos recém-nascidos. Analisamos os resultados pelo software Fusion 4.2 TM (One Lambda, Inc,).

Mãe: HLA-A2, A68; HLA-B7, B51; HLA-Cw7.

Pai: HLA-A23, A29; HLA-B8, B15 (63); HLA-Cw5, Cw7.

Filhas: HLA-A23, A68; HLA-B15 (B63); B51; HLA-Cw5.

Os alelos HLA-B15(63) e CW5 foram herdados pelas filhas, gêmeas idênticas, do seu pai biológico. Como eles não existem na mãe, foram responsáveis pelo estimulo à produção dos anticorpos existentes, talvez desde a primeira gestação.

Genotipagem HNA

A genotipagem HNA foi realizada pelo método de PCR-SSP (sequence specific primers) para os sistemas HNA-1 e 4¹⁸, e pelo método PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) para os sistemas HNA-3 e 5¹⁹. A eletroforese dos produtos de PCR for realizada em gel de agarose corado com GelRedTM (GelRed Nucleic Acid Stain, Biotium) com a adição de marcador de peso molecular (DNA Ladder, Invitrogen E-Gel). A leitura foi realizada como sistema de documentação de gel DocTMEZ Images, (Bio-Rad).

A expressão do HNA-2 for determinada por citometria de fluxo, usando o anticorpo monoclonal MEM166, conjugado a ficoeritrina (PE). O anticorpo IgG1 de camundongo foi usado com controle isotipico (Abcam, Cambridge, UK). Os dados foram analisados no programa CellQuest^® (Becton Dickinson). Indivíduos foram considerados negativos se menos de 5% de seus neutrófilos reagiram com os anticorpos monoclonais²⁰.

Os resultados da genotipagem mostram que há incompatibilidade materno-fetal para o sistema HNAA1, sendo que a mãe apresenta apenas o antígeno HNA-1b, e o pai e filhas o antígeno HNA-1a, além do HNA1b, o que justifica a imunização materna.

Mãe: HNA-1b e HNA-4a;

Pai: HNA-1a, HNA-1b e HNA-4a;

Filhas: HNA-1a, HNA-1b.

No presente caso, identificamos anticorpos mater-nos contra antígenos HNA e HLA de origem paterna, presentes nas filhas. Acredita-se que a sensibilização anti-HNA seja mais importante do que a HLA nos casos de NAN, tendo em vista que os antígenos HLA expressam-se em todas as células nucleadas do organismo, enquanto os HNA são restritos aos neutrófilos. Sendo assim, os anticorpos anti-HNA por serem mais específicos contra essas células, possivelmente tenham poder de destruição maior. A imunização HLA das multíparas é comum (42,3%) e menor com HNA (4,3%), sendo um contraste os casos de NAN acontecerem em menos de 1% dos nascimentos.

Como não se realiza hemograma em recémnascidos normais, entendemos que a patologia possa ser subdiagnosticada pela falta de sintomas no período neonatal. Os recém-nascidos com essa neutropenia silenciosa recuperam-se, mas alguns voltam posteriormente ao hospital, infectados nos primeiros meses de vida.

A citometria de fluxo realizada com o soro da mãe e os neutrófilos dos filhos é o teste mais rápido e preciso no diagnóstico precoce e tardio de NAN, entretanto não é disponível na maioria dos grandes centros no Brasil. No estado do Rio Grande do Sul, o caso relatado foi o primeiro avaliado com a metodologia adequada, sendo que se pode dizer que o diagnóstico de NAN não era realizado, acontecendo provavelmente o mesmo no resto do país e do mundo. No caso de considerarmos que o NAN acontece em 0,1% dos nascimentos⁴, possivelmente existem cerca de 140 casos/ano não diagnosticados em nosso estado. Para melhorar esta situação, devemos incentivar os laboratórios que dispõem de citômetro de fluxo para iniciarem com o teste mais simples, que é a prova cruzada contra neutrófilos. Para os que já se dedicam ao estudo de histocompatibilidade para transplantes, e que têm a prova cruzada e outros métodos em sua rotina, será muito fácil analisar esses casos de NAN, mesmo os com profunda neutropenia.

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